添加‘丹菲特’單品種葡萄酒對‘赤霞珠’葡萄酒酚類物質和顏色的影響

史 寧，盧浩成，劉 瑤，成池芳，何 非，王 軍*

（1.中國農業大學 食品科學與營養工程學院 葡萄與葡萄酒研究中心，北京 100083；2.中國農業大學 農業農村部葡萄酒加工重點實驗室，北京 100083；3.新疆中信國安葡萄酒業有限公司，新疆 瑪納斯 832200）

葡萄酒的顏色不僅能夠反映其釀造工藝水平，也是消費者評價葡萄酒質量的最重要的感官指標之一[1]。紅葡萄酒的呈色物質主要為花色苷及其衍生物，花色苷的含量、組成比例及其與其他酚類物質的聚合作用都會影響紅葡萄酒的顏色品質[2]。一方面，花色苷為葡萄酒帶來紅色色調、黃色色調以及藍色色調；另一方面，酚類物質在葡萄酒陳釀過程中相互作用形成結構穩定的色素分子。由于每個葡萄品種都有自身獨特的酚類物質組成特征，因此，很難釀造出具有完全平衡感官特征的單一品種葡萄酒，一些葡萄酒在釀造完成后表現出酚類物質水平較低，顏色表現不足的問題，嚴重影響了紅葡萄酒的質量。因此，在干紅葡萄酒生產過程中，很多葡萄酒企業常通過添加顏色表現好的葡萄酒進行調配，常用的調色品種為染色葡萄，但也使用花色苷含量相對較高的非染色品種，如‘丹菲特’等[3]。

發酵后調配是指將發酵結束后的不同品種或不同年份的葡萄酒進行不同比例的混合，有選擇地改善葡萄酒酚類物質組成和穩定顏色[3]，以達到彌補單一品種葡萄酒缺陷和改善其整體品質的技術。目前為止，關于葡萄酒發酵后調配的理論研究在中國還相對較少，葡萄酒調配仍然是一種基于釀酒師經驗的操作，且這些經驗和結果很難被其他研究人員參考，不能變成更為準確的調配方案，葡萄酒風格無法保持穩定[4]。

‘赤霞珠’是中國大部分釀酒葡萄產區的主栽品種，但不同產區的‘赤霞珠’葡萄酒在顏色上存在著很大的提升空間[5]。‘丹菲特’是近年來引進的釀酒葡萄品種，所釀造的干紅葡萄酒果味濃郁，具有極深的紫紅顏色[6]，極具調色潛力，但國內關于‘丹菲特’調配的相關報道較少。為了優化‘赤霞珠’葡萄酒的顏色品質，更好地發揮不同品種的優勢，本研究以‘赤霞珠’單品種干紅葡萄酒為基酒，利用‘丹菲特’單品種干紅葡萄酒以5%、10%、15%、20%、25%的添加比例進行調配，測定調配葡萄酒的顏色參數和酚類物質含量，以期為葡萄酒調配工藝的科學化設計提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

實驗樣品選自新疆瑪納斯縣中信國安葡萄酒業有限公司（44°14'N，86°15'E）2020年采收釀造的‘赤霞珠’（Cabernet Sauvignon）和‘丹菲特’（Dornfelder）單品種干紅葡萄酒。兩款葡萄酒的原料均為充分成熟的單品種葡萄，原料采收后按照公司生產工藝進行釀造，發酵規模為20 t。兩款單品種干紅葡萄酒蘋-乳發酵（malo-lactic fermentation，MLF）結束后一個月的基本理化指標見表1。

表1 單品種葡萄酒基本理化指標Table 1 Basic physical and chemical indexes of monovarietal wine samples

1.1.2 試劑

類黃酮標準品（二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素、兒茶素、表兒茶素、表棓兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯）、甲酸、甲醇、乙腈（均為色譜純）：德國Sigma-Aldrich公司。其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

Agilent1200系列超高效液相色譜-三重四極桿串聯質譜聯用（ultraperformanceliquidchromatography-triple quadrupole tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）儀、Poroshell 120 EC-C18色譜柱（150 mm×3.0 mm，2.7 μm）：美國Agilent科技有限公司；T6紫外分光光度計：上海普析通用儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄酒的調配

以‘赤霞珠’單品種干紅葡萄酒（CS）為基酒，‘丹菲特’單品種干紅葡萄酒（DFT）作為配體，在蘋-乳發酵結束后一個月，以5%（CD1）、10%（CD2）、15%（CD3）、20%（CD4）、25%（CD5）的比例進行調配，每個調配比例重復3次，每次重復的總體積為20 L，調配后裝入750 mL標準葡萄酒瓶，木塞封口，在酒窖瓶儲一個月后用于酚類物質分析。

1.3.2 酚類物質的檢測

樣品經0.22 μm水系濾膜過濾后，參照盧浩成等[7-8]的高效液相色譜-三重四級桿質譜聯用法測定葡萄酒中的類黃酮類物質。

氣相色譜條件：Poroshell 120 EC-C18（150 mm×3.0 mm，2.7 μm）色譜柱，柱溫55 ℃，進樣量5 μL，洗脫采用的流動相A相為0.1%的甲酸水溶液，B相為含0.1%甲酸乙腈∶甲醇=50∶50（V/V）溶液，流動相流速0.4 mL/min。花色苷的洗脫程序為10%～100%B持續15 min，后運行程序5 min。非花色苷采用梯度洗脫程序，0～28 min，10%～46%B；28～29 min，46%～10%B，后運行程序5 min。

質譜條件：電噴霧（electron spray ionization，ESI）離子源，噴霧電壓4 kV，離子源溫度150 ℃，干燥氣溫度350 ℃，流量為12 L/h，霧化器壓力35 psi。檢測器為多反應監測（multireaction monitoring，MRM）模式。花色苷的檢測采取正離子模式，非花色苷采取負離子模式。

定性、定量：依據本實驗室所建立的葡萄與葡萄酒酚類物質指紋譜庫進行定性[8]。采用外標法定量，黃酮醇以槲皮素為外標物進行定量，標準曲線回歸方程為：Y=0.000 002 6x+0.11，相關系數為0.998；黃烷醇以兒茶素、表兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯和表棓兒茶素為外標物進行定量，標準曲線回歸方程為：Y（兒茶素）=0.000 023 4x-1.50，相關系數為0.998；Y（表兒茶素）=0.000 022 5x-1.86，相關系數為0.993；Y（表棓兒茶素）=0.000 059 1x+3.37，相關系數為1.000；Y（表兒茶素沒食子酸酯）=0.000 003 7x-1.01，相關系數為0.997。花色苷以二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷為外標物進行定量，標準曲線回歸方程為：Y=0.000 004 6x-1.14，相關系數為0.998。

1.3.3 顏色參數的檢測

酒樣色度-色調的檢測采用CIELAB法[9]。酒樣經0.22 μm水系濾膜過濾后，選擇2 mm光徑石英比色皿，以蒸餾水為空白對照，用紫外分光光度計測定酒樣在波長440 nm、530 nm、600 nm處的吸光度值，計算樣品的CIELAB參數，包括L*值（明亮度）、a*值（a*＞0，紅色色調；a*＜0，綠色色調）、b*值（b*＞0，黃色色調；b*＜0，藍色色調）。

1.3.4 數據處理及統計分析

采用SPSS26.0進行統計分析，采用Excel2016制表，采用SIMCA 14.1進行主成分分析（principal component analysis，PCA），使用Excel 2016繪制色板圖。

2 結果與分析

2.1 調配葡萄酒顏色參數的分析結果

由于葡萄酒的色調、色度和CIELAB顏色評價體系的結果有著良好的相關性[10]，因此本試驗采用CIELAB法對各組葡萄酒樣品的顏色參數進行測定，結果見表2。由表2可知，‘赤霞珠’單品種干紅葡萄酒的顏色較淺（L*值最高），紅色色調低且黃色色調高（a*值最低，b*值最高），顏色表現并不突出。相反，‘丹菲特’單品種干紅葡萄酒的顏色表現好。

表2 調配葡萄酒的顏色參數Table 2 Color parameters of blending wine

2.2 花色苷酚類物質差異分析

2.2.1 單體花色苷

葡萄酒顏色的差異主要受到酚類物質的影響，其中單體花色苷是葡萄酒顏色的主要貢獻物[11]。不同酒樣中單體花色苷的含量見表3。由表3可知，各組樣品均檢測出了包括花青素類、甲基花青素類、花翠素類、甲基花翠素類、二甲花翠素類的葡萄糖苷。其中，花青素類和甲基花青素類花色苷呈現橙紅色；花翠素類、甲基花翠素類和二甲花翠素類呈現藍色[12]。各類單體花色苷的含量均隨著配體‘丹菲特’單品種干紅葡萄酒比例的增加而增大，二甲花翠素類花色苷含量最高，是葡萄酒呈現藍色色調的最主要的花色苷。

表3 調配葡萄酒中單體花色苷含量的測定結果Table 3 Determination results of mono-anthocyanins contents in blending wine mg/L

由表3亦可知，在各類單體花色苷中均檢測到了乙酰化和香豆酰化葡萄糖苷。酰化作為酚類物質最常見的修飾方式之一，不僅能夠使花色苷的顏色加深，還能對花色苷顏色的穩定起到促進作用，未經酰化的花色苷由于沒有酰基保護很容易在弱酸性或中性條件下脫色[13]。隨著配體‘丹菲特’單品種干紅葡萄酒比例的上升，酰化花色苷的含量顯著增大（P＜0.05），提高了葡萄酒顏色的穩定性及其陳釀潛力。

2.2.2 聚合花色苷

聚合花色苷是由單體花色苷經過聚合或加成反應生成的花色苷衍生物，能夠使單體花色苷的最大吸收波長發生偏移，從而在一定程度上影響葡萄酒的顏色[14]。不同酒樣中聚合花色苷的含量見表4。由表4可知，從樣品中共檢測出4種聚合花色苷，包括乙醛橋連聚合花色苷、乙烯基黃烷醇吡喃花色苷、乙醛復合型吡喃花色苷和酚基吡喃花色苷[15]。二甲花翠素能夠通過乙醛介導與黃烷醇聚合形成乙醛橋連聚合花色苷，引起最大吸收波長紅移，增強葡萄酒的顏色[16-17]。此外，也有研究表明，乙烯基黃烷醇吡喃花色苷也能夠引起最大吸收波長發生紅移[18]，顯示出紅紫色和深藍色[16]。由于‘丹菲特’單品種干紅葡萄酒中乙醛橋連聚合花色苷和乙烯基黃烷醇吡喃花色苷的含量顯著低于‘赤霞珠’單品種干紅葡萄酒（P＜0.05），顯著降低了這兩種聚合花色苷在調配葡萄酒中的含量。酰化花色苷與丙酮酸和乙醛聚合形成的乙醛復合型花色苷能引起明顯的藍移，在葡萄酒中呈現出橙黃色[19]。‘丹菲特’單品種葡萄酒中的乙烯基黃烷醇吡喃花色苷含量顯著低于‘赤霞珠’單品種干紅葡萄酒（P＜0.05），但在調配酒樣中的含量無明顯下降（P＞0.05）。酚基吡喃花色苷是花色苷與乙烯基愈創木酚、4-乙烯基兒茶酚和4-乙烯基酚聚合形成的花色苷衍生物，能引起最大吸收波長藍移[20]，在葡萄酒中呈現出橙紅色[21]。‘丹菲特’單品種葡萄酒中有較高含量的酚基吡喃花色苷，在調配過程中顯著增加了調配酒樣中的酚基花色苷含量，對‘赤霞珠’單品種干紅葡萄酒顯示出的紅紫色有影響。聚合花色苷的總含量隨‘丹菲特’單品種葡萄酒添加比例的上升而增大，能夠增強調配葡萄酒的顏色表現和穩定性。

表4 調配葡萄酒中聚合花色苷含量的測定結果Table 4 Determination results of poly-anthocyanins contents in blending winemg/L

2.3 非花色苷酚類物質差異分析

2.3.1 黃酮醇

對于干紅葡萄酒而言，黃酮醇類化合物是一種很好的輔色素因子[22]。黃酮醇主要以糖苷結合的形式存在于葡萄酒中，可以與花色苷形成更穩定的色素復合體，引起最大吸收波長紅移，改善干紅葡萄酒的顏色表現[23]。不同酒樣中黃酮醇的含量見表5。

由表5可知，從酒樣中共檢測到13種黃酮醇類物質，包括山奈酚類、槲皮素類、楊梅酮類、異鼠李素類和丁香亭類化合物，其中槲皮素類黃酮醇在各組酒樣中的含量是5類黃酮醇中最高的。在pH為3.5的條件下，槲皮素是各類黃酮醇中較為有效的輔色素因子，能夠形成穩定性較高的色素復合體[24]。在調配過程中，槲皮素類黃酮醇的含量隨‘丹菲特’單品種葡萄酒的添加比例增高而增大，其余各類黃酮醇含量均表現出與槲皮素一致的上升趨勢。由表6亦可知，黃酮醇總含量隨著‘丹菲特’單品種干紅葡萄酒添加比例的增高而增大，在一定程度上提高了‘赤霞珠’單品種干紅葡萄酒的顏色品質。

表5 調配葡萄酒中黃酮醇含量的測定結果Table 5 Determination results of flavonols contents in blending wine mg/L

2.3.2 黃烷醇

黃烷醇的輔色效果相對有限，但其在數量上占有優勢，因此，黃烷醇類物質仍然能夠成為一種較為理想的輔色素因子[25]。由表6可知，在各組酒樣中共測得5種黃烷醇類物質，分別為兒茶素、表兒茶素、表棓兒茶素、原花青素二聚體B1和原花青素二聚體B2，其中兒茶素分子的空間結構易造成位阻效應，阻礙了與花色苷的組合，從而影響了輔色作用的發生[26]。兒茶素在‘赤霞珠’單品種干紅葡萄酒中的含量隨著‘丹菲特’單品種葡萄酒的添加而下降，有利于干紅葡萄酒顏色的表現。表兒茶素與兒茶素相比，其結構中的異構化可以與花色苷分子較好的結合在一起，具有很好的輔色化表現[27]。此外，二聚體的花青素分子也被證實具有一定的輔色能力[25]。但由于表兒茶素及原花青素二聚體B2在‘丹菲特’單品種葡萄酒中的含量較低，調配過程并沒有顯著增加這兩種物質在‘赤霞珠’單品種干紅葡萄酒中的含量。而原花青素二聚體B1的含量隨‘丹菲特’單品種干紅葡萄酒的添加而逐漸增高，對于‘赤霞珠’干紅葡萄酒的顏色是一種良性的變化。

表6 調配葡萄酒中黃烷醇含量的測定結果Table 6 Determination results of flavanols contents in blending wine mg/L

2.4 基于葡萄酒酚類物質含量調配萄葡酒樣品的主成分分析

葡萄酒中酚類物質間復雜的聚合或輔色反應為預測調配葡萄酒的顏色品質提高了難度[28]。本研究對‘赤霞珠’、‘丹菲特’兩款單品種干紅葡萄酒和5組調配葡萄酒的酚類物質含量進行主成分分析，結果見圖1。由圖1可知，主成分1的方差貢獻率為90.8%，主成分2的方差貢獻率為7.73%，說明前兩個主成分共解釋了98.53%的變量。主成分1能將基酒、配體酒和調配酒區分開，黃酮醇類、單體花色苷類物質位于x軸的正半軸，說明隨著‘丹菲特’單品種干紅葡萄酒添加比例的提高，這些物質的含量逐漸增大。而大部分黃烷醇類、聚合花色苷類物質位于x軸的負半軸，說明調配降低了部分黃烷醇類和聚合花色苷類物質含量。主成分2將添加20%和25%的‘丹菲特’單品種干紅葡萄酒的調配葡萄酒（CD4和CD5）與其余葡萄酒區分開，主要貢獻物質是黃烷醇類和黃酮醇類物質。大部分的黃烷醇類和黃酮醇類物質位于y軸的正半軸，說明CD4和CD5葡萄酒樣品中含有較高含量的黃烷醇和黃酮醇。結合兩個主成分來看，本試驗所設計的‘丹菲特’單品種干紅葡萄酒添加比例對‘赤霞珠’單品種干紅葡萄酒的酚類物質均有積極的作用，其中‘丹菲特’葡萄酒占比在20%和25%時的調配效果較好。

圖1 基于葡萄酒酚類物質含量調配萄葡酒樣品的主成分分析得分圖（a）和載荷圖（b）Fig.1 Principal component analysis score plot (a) and loading plot (b) of blending wine samples based on phenols contents in wine

3 結論

本研究將‘丹菲特’單品種干紅葡萄酒作為配體，與‘赤霞珠’單品種干紅葡萄酒在發酵后按5種比例進行二元調配。結果表明，在調配過程中，‘丹菲特’單品種干紅葡萄酒能夠提高‘赤霞珠’干紅葡萄酒的紅色色調，降低黃色色調，加強其顏色表現。此外，‘丹菲特’單品種干紅葡萄酒能夠賦予‘赤霞珠’干紅葡萄酒更高的花色苷類和黃酮醇類物質含量，提高其酚類物質水平。結合酚類物質含量進行主成分分析，發現‘丹菲特’單品種干紅葡萄酒占比在20%和25%時對‘赤霞珠’干紅葡萄酒均有較好的效果，本研究結果能夠為解決新疆產區‘赤霞珠’干紅葡萄酒的顏色品質問題提供基本參考。