產(chǎn)愈創(chuàng)木酚類功能菌篩選及其在清香型小曲白酒中的應(yīng)用

林 斌，楊 強，宿智新，江 威，李 群，朱麗萍，陳申習

（勁牌有限公司 勁牌研究院 中藥保健食品質(zhì)量與安全湖北省重點實驗室，湖北 黃石 435100）

中國白酒作為世界六大蒸餾酒之一，復雜的釀造工藝造就了其獨特風味口感。白酒中含有大量豐富的揮發(fā)性物質(zhì)，如醇、酸、酯、酚、吡嗪和萜烯等，它們構(gòu)成了白酒風味的主體成分，除此之外白酒中還含有諸多非揮發(fā)性物質(zhì)，如氨基酸、維生素、活性肽等[1-3]，這些風味物質(zhì)組合賦予白酒不同的色香味風格。愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)是一類存在于醬香、濃香、芝麻香和清香型等白酒中的呈香風味因子，其中愈創(chuàng)木酚、4-甲基愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚和4-乙烯基愈創(chuàng)木酚具有獨特發(fā)酵香味（煙熏、醬香、丁香和辛香味等），且呈現(xiàn)味閾值低，對白酒香氣風味具有重要的貢獻[4-5]。

國內(nèi)研究對中國各大香型白酒中風味物質(zhì)成分進行檢測分析，發(fā)現(xiàn)愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)含量在醬香型白酒中最高，其次是濃香型白酒，而清香型白酒中愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)較少[6]。孫嘯濤等[7]采用氣質(zhì)聯(lián)用（gas chromatographymass spectrometer，GC-MS）技術(shù)對53種白酒中愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)進行了定量檢測，其中，4-甲基愈創(chuàng)木酚含量為2.8～1 709 μg/L，4-乙基愈創(chuàng)木酚含量為1.3～1 167 μg/L。愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)不僅在白酒中具有較高的香氣活性值（odor activity value，OAV），而且可作為天然自由基清除劑，能夠抗氧化消除細胞中活性氧和自由基，促進微循環(huán)，增強人體免疫力，預防心血管等多種疾病的發(fā)生，具有抗衰老、促進人體健康的作用[8-9]。小鼠實驗研究表明，在白酒中添加4-甲基愈創(chuàng)木酚能有效減輕酒精肝損傷，緩解酒精所帶來的肝功能紊亂和失調(diào)[10]。

隨著中國社會穩(wěn)步發(fā)展以及新冠疫情預防常態(tài)化，人們對于健康食品的需求也與日俱增。作為中國白酒主要香型之一的清香型白酒，在不斷改善風味和提高品質(zhì)同時，也需要提升酒體中健康因子含量，為消費者提供品質(zhì)更好更健康的產(chǎn)品。微生物的生物轉(zhuǎn)化是中國白酒中風味功能因子的重要來源，因此篩選產(chǎn)健康因子的功能菌株用于提升白酒中風味功能因子已成為當前白酒微生物研究領(lǐng)域的熱點之一。目前關(guān)于產(chǎn)愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)菌株篩選應(yīng)用集中于醬香型、芝麻型和濃香型白酒生產(chǎn)中[11-14]。且篩選獲得的菌株多以芽孢桿菌為主，芽孢桿菌作為中國白酒發(fā)酵過程中優(yōu)勢的細菌類群[15-17]，可以代謝產(chǎn)愈創(chuàng)木酚類因子，極大地豐富中國白酒的風味和健康內(nèi)涵[18]。該研究以清香型小曲為原料進行高產(chǎn)愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)的菌株篩選，通過顯色初篩和發(fā)酵復篩獲得菌株，并利用車間中試釀造實驗探究菌株的應(yīng)用前景，以期用于生產(chǎn)中增加清香型小曲白酒中愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)含量，提升酒體健康內(nèi)涵。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

分離菌株：取自于湖北黃石大冶勁牌有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

Luria-Bertani（LB）液體培養(yǎng)基：氯化鈉10g，蛋白胨10g，酵母浸粉5 g，水1 000 mL，pH=7.0，置于滅菌鍋121 ℃滅菌30 min，備用。固體培養(yǎng)基加瓊脂20 g。

酵母浸粉葡萄糖淀粉（yeastextractglucose starch，YGS）培養(yǎng)基：葡萄糖2 g，酵母浸粉1 g，淀粉1 g，香草酸0.1 g，加入1 000 mL水加熱溶解，置于滅菌鍋121 ℃滅菌30 min，備用。

高粱汁發(fā)酵培養(yǎng)基：取1 kg高粱，將其破碎成粉狀，與5 L水混合，加入5 g淀粉酶60 ℃條件下作用1～2 h，然后105 ℃、30 min處理，冷卻后加入5 g糖化酶和5 g淀粉酶，60 ℃處理24 h。用離心機和抽濾機過濾，糖度調(diào)節(jié)到8°Bx，裝瓶置于滅菌鍋121 ℃滅菌30 min，備用。

1.1.3 主要試劑

淀粉酶（5萬U/g）、糖化酶（10萬U/g）：無錫雪梅酶制劑科技有限公司；辣根過氧化物酶（250 U/mg）：武漢白浩天生物科技有限公司；TIANGEN土壤基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：天根生化科技有限公司；愈創(chuàng)木酚、4-甲基愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚（均為色譜純）：美國Sigma公司；乙酸乙酯、正丙醇、異丁醇、異戊醇（均為色譜純）：美國SAFC Biosciences公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

AL204電子分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；全溫空氣搖床QYC-200：上海福瑪實驗設(shè)備有限公司；生化培養(yǎng)箱SPX-100B-Z：上海博訊實業(yè)有限公司；Nikon Eclipse E200顯微鏡：日本Nikon公司；ABI 2720聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）熱循環(huán)儀：美國ABI公司；7890B-5977B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、DB-FFAP毛細管色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）、CP-WAX毛細管色譜柱（50 m×0.25 mm，0.2 μm）：美國安捷倫科技有限公司；頂空固相微萃?。╤eadspace solid phase micro-extraction，SPME）手動進樣手柄、DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭（50/30 μm）：美國色譜科公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 酒曲中細菌分離

取10 g酒曲加入90 mL的無菌水中37 ℃振蕩20 min，之后依次進行梯度稀釋（10-1、10-2、10-3、10-4和10-5），選取梯度為10-4和10-5的稀釋液涂布于含有0.05 mg/mL制霉菌素的LB培養(yǎng)基平板上，放入37 ℃培養(yǎng)箱中，觀察菌株生長情況。根據(jù)菌株的菌落形態(tài)、大小、顏色等特征，挑取細菌菌株于LB培養(yǎng)基平板上劃線純化，37 ℃培養(yǎng)24 h獲得純化菌株，備用。

1.3.2 高產(chǎn)愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)菌株的篩選

（1）產(chǎn)愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)菌株的初篩

初篩選用顯色方法，即愈創(chuàng)木酚在過氧化物酶的催化下與過氧化氫反應(yīng)，生成四愈創(chuàng)醌（紅褐色），在波長470 nm處有較強的吸收峰。將反應(yīng)產(chǎn)色的菌株接種于YGS培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)24 h。取2 mL菌液加入反應(yīng)體系（2 mL 0.2 mol/L磷酸緩沖液（pH=6.0）+20 μL辣根過氧化物酶（5 U）＋300 μL 0.5%H2O2）。將反應(yīng)液常溫靜置5 min后觀察反應(yīng)體系顏色變化。根據(jù)是否產(chǎn)生紅褐色來判斷各菌株是否可以代謝產(chǎn)生愈創(chuàng)木酚[19]。

（2）產(chǎn)愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)菌株的復篩

從平板上挑取細菌菌落接種到10 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃160 r/min培養(yǎng)24 h后轉(zhuǎn)接于50 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h后用于后續(xù)發(fā)酵接種。將所分離各菌的種子液按2%（V/V）接種量接入高粱汁發(fā)酵培養(yǎng)基50 mL中，瓶口用發(fā)酵栓密封于30 ℃靜置培養(yǎng)7 d。

將標準化合物（愈創(chuàng)木酚、4-甲基愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚和4-乙烯基愈創(chuàng)木酚）溶解在無水乙醇溶液中，稀釋成不同梯度工作標準液，取8 mL于頂空進樣瓶中，加入3 g氯化鈉和80 μL內(nèi)標溶液（2,6-二甲基苯酚，100 mg/L），混勻后進行GC-MS分析。

1.3.3 檢測條件

將頂空固相微萃取頭插入樣品瓶頂空部分，70 ℃保溫萃取50 min。萃取結(jié)束后進樣，250 ℃解吸5 min。氣相色譜條件：色譜柱為DB-FFAP毛細管柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：起始溫度50 ℃，保持2 min，以5 ℃/min升溫至240 ℃，保留1 min；進樣口溫度250 ℃；載氣為氦氣（He）（純度＞99.99%）。質(zhì)譜條件：電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，掃描范圍40～550 amu。先確定愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)的保留時間，對質(zhì)譜圖解析進行分組后，采用選擇離子模式定量分析。以質(zhì)量濃度比為橫坐標，愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)與內(nèi)標物的峰面積比為縱坐標，建立愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)標準曲線。其標準曲線的回歸方程分別為y=0.166 8x+0.010 3，R2=0.999 4（愈創(chuàng)木酚）；y=0.452 3x+0.046 4，R2=0.998 8（4-甲基愈創(chuàng)木酚）；y=1.646 8x+0.099 4，R2=0.999 8（4-乙基愈創(chuàng)木酚）；y=0.202 6x-0.015 8，R2=0.998 9（4-乙烯基愈創(chuàng)木酚）。

使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對發(fā)酵上清液中愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)進行定量檢測。取8 mL待測樣品于20 mL頂空瓶中，加入3 g氯化鈉和80 μL內(nèi)標溶液，混合均勻后進行分析。樣品進樣萃取、分析和色譜條件參照標準曲線條件進行。采用愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)標準曲線計算樣品中愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)的含量。

1.3.4 菌株的鑒定

（1）顯微形態(tài)觀察

觀察37 ℃培養(yǎng)條件下LB培養(yǎng)基上細菌菌落形態(tài)；用接種針或者滅菌牙簽挑取少量菌體放于載玻片中，于顯微鏡（10×100）下進行菌體顯微觀察。

（2）生理生化實驗

參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[20]對菌株B257進行生理生化實驗。

（3）分子序列分析鑒定

16S rRNA基因片段PCR擴增反應(yīng)：以所提取的菌株B257的DNA為模板，利用細菌16S rRNA通用引物27F（5'-AGAGTTTGGATCMTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3'）進行16S rRNA片段擴增。擴增體系為30 μL，其中PremixTaqTM15 μL，雙蒸水（ddH2O）13 μL，引物27F和1492R各為0.5 μL，DNA模板1 μL。擴增條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，53 ℃退火50 s，72 ℃延伸30 s，32個循環(huán)；72 ℃再延伸10 mim，4 ℃保存。

16S rRNA序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建：將擴增的16S rRNA片段送往武漢華大基因生物醫(yī)學工程有限公司進行測序，獲得菌株B257的16S rRNA序列信息。通過美國國家生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站（national center for biotechnology information，NCBI）的基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）進行同源性比較，獲取其同源性序列。并進一步利用MEGA-X軟件鄰接法（neighbor-joining，NJ）對所獲得同源性菌株序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定菌株B257分類學地位。

1.3.5 菌株B257的耐受性實驗

參照1.3.2步驟制備成菌株B257種子液，將種子液按照5%（V/V）的接種量[12]分別接種于不同pH（2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5）、不同NaCl含量（1%、3%、5%、7%、9%、11%、13%、15%、17%）、不同乙醇體積分數(shù)（3%、6%、9%、12%、15%、18%）的LB液體培養(yǎng)基。37 ℃、160 r/min培養(yǎng)24 h后，取細菌培養(yǎng)液于波長600 nm處測定吸光度值。

1.3.6 產(chǎn)愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)菌株在清香型小曲白酒釀造中的應(yīng)用

（1）實驗用曲制備

以5%的比例將菌株B257的種子液添加到滅菌麩皮中，培養(yǎng)3 d后烘干。按照2%比例添加至生產(chǎn)所用清香型小曲中用于菌株中試效果驗證。

（2）高粱發(fā)酵中試試驗

將所配制的實驗曲30 g與蒸煮兩次的高粱3 kg混合均勻，30 ℃條件下糖化24 h，后與6 kg酒糟混合拌勻放入發(fā)酵桶中，30 ℃恒溫車間發(fā)酵14 d（對照為不添加菌株B257的小曲）。待發(fā)酵完畢，將酒醅裝入酒甑進行蒸汽餾酒，蒸餾出酒樣取500 mL，對其中關(guān)鍵風味物質(zhì)和愈創(chuàng)木酚類健康因子進行定量檢測。

（3）風味成分檢測

采用氣相色譜技術(shù)對白酒中風味成分（乙酸乙酯、正丙醇、異丁醇、異戊醇）進行定量檢測。樣品前處理、進樣分析和色譜條件參照文獻[21]的條件。酒樣中愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)含量采用GC-MS檢測，色譜條件如1.3.3所示。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

采用安捷倫MSD ChemStation軟件處理氣相色譜-質(zhì)譜數(shù)據(jù)；菌株吸光度值和發(fā)酵風味色譜數(shù)據(jù)經(jīng)IBM SPSS 19統(tǒng)計分析軟件進行整理統(tǒng)計，由Origin 2019作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)菌株篩選

2.1.1 菌株的初篩

采用顯色法對從清香型小曲中所分離出細菌菌株進行了產(chǎn)愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)篩選，結(jié)果顯示共有10株菌（B73、B79、B81、B99、B109、B167、B172、B209、B213、B257）在顯色反應(yīng)體系中產(chǎn)生紅褐色物質(zhì)，表明這些菌具有代謝產(chǎn)愈創(chuàng)木酚的能力，因此將這10株菌用于下一步的液體發(fā)酵復篩。

2.1.2 菌株的復篩

為進一步探究這些菌株在清香型小曲白酒發(fā)酵體系中產(chǎn)愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)（愈創(chuàng)木酚、4-甲基愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚和4-乙烯基愈創(chuàng)木酚）能力，選取高粱汁培養(yǎng)基作為復篩培養(yǎng)基模擬清香型小曲白酒的密閉發(fā)酵環(huán)境，并采用GC-MS對10株芽孢桿菌發(fā)酵液中愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)含量進行定量分析，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，菌株B73、B79、B81和B257產(chǎn)生愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)含量較高，總量在0.41～9.70 mg/L，主要為愈創(chuàng)木酚和4-乙烯基愈創(chuàng)木酚。其中菌株B257代謝產(chǎn)愈創(chuàng)木酚和4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的含量較高，為1.04 mg/L和8.65 mg/L，分別比其他3株菌高出了132%～1 205%以及381%～2 269%；而4株菌的4-甲基愈創(chuàng)木酚和4-乙基愈創(chuàng)木酚含量較低，分別在0.001～0.008 mg/L和0.001～0.012 mg/L之間。其余6株芽孢桿菌高粱汁發(fā)酵液中愈創(chuàng)木酚含量極低，未檢測出，因此在圖1中未展示。綜上可以看出，菌株B257具有較好的產(chǎn)愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)的能力。

圖1 四株細菌高粱汁發(fā)酵培養(yǎng)基中產(chǎn)愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)含量Fig.1 Contents of guaiacols in fermentation medium of sorghum juice from 4 bacterial strains

2.2 菌株B257的鑒定

2.2.1 菌株B257的菌落和細胞顯微形態(tài)

為確定菌株B257的系統(tǒng)發(fā)育學地位，對其菌落形態(tài)和顯微形態(tài)進行觀察，結(jié)果見圖2。由圖2可知，菌株B257在LB培養(yǎng)基平板上菌落呈乳白色、不透明，表面褶皺不光滑，菌落邊緣粗糙擴散；在10×100倍光學顯微鏡下菌體呈短桿狀，長度1.5～3 μm，寬度0.6～0.9 μm，無莢膜，中生芽孢，革蘭氏染色陽性。對照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》描述，菌株B257與芽孢桿菌形態(tài)特征相似，故菌株B257被初步鑒定為芽孢桿菌（Bacillussp.）[20]。

圖2 菌株B257的菌落形態(tài)（A）和細胞顯微結(jié)構(gòu)（B）Fig.2 Colony morphology (A) and cell microstructure (B) of strain B257

2.2.2 菌株B257生理生化特征分析

對菌株B257的生理生化特性進行了檢測，結(jié)果見表1。由表1可知，該菌株過氧化酶實驗、V-P實驗、甲基紅實驗陽性，可水解明膠和淀粉，可利用檸檬酸鹽代謝葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸。與此同時，糖發(fā)酵實驗顯示該菌株可以代謝葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖、甘露糖、海藻糖、山梨醇和阿拉伯糖產(chǎn)酸，但無法利用乳糖。

表1 菌株B257生理生化特性實驗結(jié)果Table 1 Experimental results of physiological and biochemical properties of strain B257

2.2.3 菌株B257的系統(tǒng)發(fā)育學分析

為了進一步明確菌株B257的分類學地位，對其16SrRNA序列進行分析，通過測序和同源性比對，構(gòu)建了分子系統(tǒng)進化樹，結(jié)果見圖3。由圖3可知，菌株B257與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）聚類在分類進化樹的一支，因此將菌株B257鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

圖3 基于16S rRNA基因序列菌株B257的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequence of strain B257

2.3 枯草芽孢桿菌B257的耐受性實驗

為探究菌株B257的酸、鹽、乙醇耐受性，對菌株B257在不同培養(yǎng)環(huán)境下的細胞生長活性進行了檢測，結(jié)果見圖4。由圖4可知，菌株B257在不同pH、NaCl含量和乙醇體積分數(shù)條件下呈現(xiàn)出不同生長活性，其中pH在4.5～6.5、NaCl含量在1%～9%以及乙醇體積分數(shù)為3%～6%條件下，菌株B257的生長活性較好，而pH在2.5～4.0、NaCl含量在11%～17%以及乙醇體積分數(shù)為9%～18%條件下，細胞生長受到抑制?？梢娋闎257可以在低酒精度、偏酸性和低鹽條件下具有較好細胞生長活性。清香型小曲白酒發(fā)酵初期，相關(guān)功能微生物類群會在弱酸、低酒精度環(huán)境下增殖代謝產(chǎn)生風味物質(zhì)[22]，而菌株B257的耐酸和耐酒精特性有益于其在小曲白酒發(fā)酵過程中發(fā)揮其產(chǎn)功能因子特性，提升酒體中愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)含量。

圖4 菌株B257在不同培養(yǎng)條件下的生長情況Fig.4 Growth situation of strain B257 with different culture conditions

2.4 菌株B257在清香型小曲白酒釀造中的應(yīng)用

為進一步探究枯草芽孢桿菌B257在清香型小曲白酒釀造中應(yīng)用潛力，將其麩皮種按2%比例與清香型小曲混合（即2%B257麩皮種加98%清香型小曲）作為發(fā)酵劑與高粱混合進行白酒釀造實驗，對照組則以不添加B257的清香型小曲進行糧食發(fā)酵，發(fā)酵完后獲取基酒樣品采用氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)檢測其中愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)和出酒率、主體風味成分（乙酸乙酯、正丙醇、異丁醇和異丙醇）含量，結(jié)果分別見圖5和圖6。

圖5 菌株B257對清香型小曲白酒中愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)含量的影響Fig.5 Effects of strain B257 on guaiacols contents in light-flavor Xiaoqu Baijiu

圖6 菌株B257對清香型小曲白酒出酒率和主體風味物質(zhì)含量的影響Fig.6 Effects of strain B257 on liquor yield and main flavor substances contents in light-flavor Xiaoqu Baijiu

由圖5可知，在愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)方面，添加了枯草芽孢桿菌B257所釀造的白酒中愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)總含量為4.21mg/L，與對照組未添加菌株B257的1.94 mg/L相比提升了117%。其中4-乙烯基愈創(chuàng)木酚提升量最高，增長了2.29 mg/L，4-乙烯基愈創(chuàng)木酚作為白酒中的特殊健康因子，可以有效抑制癌癥細胞生長，具有較高的醫(yī)療保健價值[23-24]。鞏園園等[25]從濃香型酒醅中篩選出一株高產(chǎn)4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的枯草芽孢桿菌NF-1（0.3 mg/g），并進一步驗證了酚酸脫羧酶是4-乙烯基愈創(chuàng)木酚代謝途徑關(guān)鍵酶。與此同時，酒樣中愈創(chuàng)木酚、4-甲基愈創(chuàng)木酚和4-乙基愈創(chuàng)木酚含量也有所增加，分別提升了400%、122%和122%。可見功能菌B257極大地提升了清香型小曲白酒中愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)含量。

由圖6可知，從基酒出酒率數(shù)據(jù)上看，添加了健康功能菌B257的酒曲未對出酒率造成明顯的影響，這可能是由于菌株B257與釀酒酵母之間并不存在有效種間競爭。在主體風味物質(zhì)方面，實驗組酒體的主要風味酯-乙酸乙酯的含量提升了26.1%。而正丙醇、異丁醇和異戊醇也出現(xiàn)了增長，分別增長了116%、16%和23.7%。芽孢桿菌的添加可以在保證出酒率和主體風味成分的基礎(chǔ)上，在一定程度上提升發(fā)酵糧食中產(chǎn)酯酵母活性，促進酯類物質(zhì)和多元醇的代謝合成[26]。

3 結(jié)論

愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)是中國白酒中一類重要的風味健康成分，它不僅能提升酒體香氣口感，還能賦予白酒健康內(nèi)涵。因此提升清香型小曲白酒中愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)含量具有重要意義。本研究從清香型小曲中分離出一株高產(chǎn)愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)的菌株B257，經(jīng)過形態(tài)學分析和16S rRNA序列同源性比對鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），且高粱汁發(fā)酵實驗發(fā)現(xiàn)菌株B257具有較好代謝合成愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)的能力。菌株B257可以耐受低鹽、低pH、偏酸性的環(huán)境，可以適應(yīng)清香型小曲白酒發(fā)酵環(huán)境，產(chǎn)生微量風味物質(zhì)。

對該菌株在小曲酒發(fā)酵中代謝合成愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)能力開展了進一步驗證，將菌株B257加入小曲中進行小曲白酒發(fā)酵（中試規(guī)模），結(jié)果顯示B257的添加可以極大提升原酒中愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)的含量，相比對照提升了117%，其中4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的含量最高。由此可見枯草芽孢桿菌B257在提升清香型小曲白酒風味和健康上具有極大的應(yīng)用潛力。因此下面將進一步開展大生產(chǎn)實驗，有效調(diào)控B257的生長代謝來提升清香型小曲白酒中愈創(chuàng)木酚類物質(zhì)含量。