高產四甲基吡嗪微生物的篩選、鑒定及發酵條件優化

郭春生，楊 舟，喬月梅，楊 婧，趙永紅，李林達，李力群*

（1.內蒙古昆明卷煙有限責任公司，內蒙古 呼和浩特 010020；2.內蒙古農業大學 食品科學與工程學院，內蒙古 呼和浩特 010018）

四甲基吡嗪（tetramethylpyrazine，TTMP）又名川芎嗪，是醬香型白酒中重要的香氣成分，具有發酵、烘烤、可可等氣味[1-3]，其作為川穹的有效藥用成分，在治愈呼吸系統疾病、缺血性血管疾病、腎小球疾病等臨床疾病上有顯著的效果，同時作為香料廣泛應用于食品調香中[4-9]。目前，四甲基吡嗪的合成方法有直接提取法、化學合成法和微生物發酵法[10]。與其他方法相比，微生物發酵法產生四甲基吡嗪具有原料廣泛、反應條件溫和、對環境污染小等優點。雖然價格昂貴，但消費者更傾向于這種天然的四甲基吡嗪[11]。

微生物以淀粉質原料為底物生成乙偶姻，在發酵過程中蛋白質被分解成氨基酸，氨基酸在谷氨酸脫氫酶作用下生成氨，乙偶姻和氨在高溫條件下生成四甲基吡嗪[12-14]。目前，產生四甲基吡嗪的菌種有芽孢桿菌（Bacillus）[15]、谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum）[16]和醋酸桿菌（Acetobacter aceti）[17]等。其中，以芽孢桿菌液態發酵相關研究最多，但微生物發酵法產四甲基吡嗪存在產量低的問題。有研究表明，通過誘變處理[18]、基因工程手段[19]及發酵過程優化[20]的方式均能進一步提高四甲基吡嗪的產量，但是作為應用于食品的風味物質，通過基因工程的方式獲得高產四甲基吡嗪菌的應用還存在爭議。因此，篩選高產四甲基吡嗪的天然菌株具有重要的意義。

有研究表明，芽孢桿菌為產四甲基吡嗪的主要菌株，且在高溫大曲中含有大量的芽孢桿菌屬微生物[21]。基于此，本研究以高溫大曲為材料，采用傳統培養分離及高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法分離篩選高產四甲基吡嗪的芽孢桿菌菌株，通過分子生物學技術對其進行菌種鑒定，并通過單因素試驗和響應面試驗對其產四甲基吡嗪的發酵工藝進行優化，以期為進一步提高四甲基吡嗪的生產提供菌種來源，并為其應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

高溫大曲：2019年7月采集自內蒙古某濃香型白酒企業，分別取五塊大曲粉碎后混勻作為實驗樣品，室溫保存。

1.1.2 試劑

葡萄糖、磷酸氫二銨、氯化鈉（均為分析純）：天津市智遠化學試劑有限公司；胰蛋白胨、酵母提取粉、瓊脂（均為生化試劑）：廣東桓凱微生物科技有限公司；甲醇、三氟乙酸（均為色譜純）：天津市廣大化學試劑有限公司；四甲基吡嗪（色譜純）、乙偶姻（分析純）：阿拉丁試劑（上海）有限公司；細菌基因組提取試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司。

1.1.3 培養基

LB固態培養基[22]：NaCL 10.0 g/L、胰蛋白胨10.0 g/L、酵母提取粉5.0 g/L，瓊脂20 g/L，pH 7.0，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

發酵培養基[23]：胰蛋白胨30.0 g/L、磷酸氫二銨30.0 g/L、酵母提取粉10.0 g/L、葡萄糖50.0 g/L，pH 7.0，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

HCB-1300V潔凈工作臺、THZ-98C恒溫振蕩器、DHG-9053A電熱恒溫鼓風干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司；SX-500全自動高壓滅菌鍋：上海新普儀器設備有限公司；GM-2真空抽濾系統：天津津騰實驗設備有限公司；3-18KS高速離心機：上海成貫儀器有限公司；U3000高效液相色譜儀、Veriti96聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：上海賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 芽孢桿菌菌株的分離及純化

稱研磨后的高溫大曲10.0 g，加90 mL無菌生理鹽水于三角瓶中，在37 ℃、180 r/min條件下振蕩培養1 h，于80 ℃條件下水浴30 min[21]。將菌懸液稀釋后涂布于LB固體培養基上，37 ℃條件下培養24 h。挑取單菌落接種于LB固體培養基上進行純化，將純化后的菌株4 ℃保存備用。

1.3.2 產四甲基吡嗪菌株的篩選

挑取分離得到的單菌落接種于裝有50 mL發酵培養基的250 mL三角瓶中，在37 ℃、180 r/min條件下振蕩培養72 h。發酵結束后將發酵液用體積分數70%的甲醇稀釋并提取，10 000 r/min離心10 min，上清液過0.22 μm有機濾膜后，采用HPLC法對上清液中四甲基吡嗪含量進行檢測。

1.3.3 分析檢測

四甲基吡嗪含量的測定：采用高效液相色譜法[24]。

殘糖含量的測定：采用3,5-二硝基水楊酸比色法[8]。

乙偶姻含量的測定：采用高效液相色譜法[25]。

OD600nm值的測定：以蒸餾水為空白對照，在波長600 nm處測定發酵液的吸光度值，用OD600nm值表示菌體量。

1.3.4 產四甲基吡嗪菌株的分子生物學鑒定

利用細菌基因組提取試劑盒提取產TTMP菌株的基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA），以其為模板，采用細菌通用引物1492R（5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'）和27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）對菌株的16S rDNA基因序列進行PCR擴增。PCR擴增體系（25 μL）：引物1492R和27F各1.0 μL，Mix 12.5 μL，DNA模板1.0 μL，雙蒸水（ddH2O）9.5 μL。PCR擴增程序：94 ℃預變性10 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸1.5 min，共30個循環；72 ℃再延伸10 min。PCR擴增結束后，取1 μLPCR擴增產物，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測合格后委托測序生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。將測序結果提交至美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數據庫中，采用基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）對測序結果進行同源檢索，選取同源性高的模式菌株的16S rDNA基因序列，采用MEGA10.0軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構建系統發育樹，對菌株進行菌種鑒定。

1.3.5 菌株產四甲基吡嗪發酵工藝優化

（1）單因素試驗

固定初始發酵條件為初始pH值7.0、接種量5%、發酵溫度37 ℃、裝液量20%、轉速180 r/min、無銨鹽添加、發酵時間10 d。結合文獻[26-28]，采用單因素輪換法依次考察初始pH值（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）、發酵溫度（30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃）和銨鹽（磷酸氫二銨）添加量（20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L、60 g/L，在發酵第6天時添加）對四甲基吡嗪、乙偶姻、殘糖含量及OD600nm值的影響。

（2）響應面試驗

在單因素試驗結果基礎上，以發酵溫度（A）、初始pH值（B）、銨鹽添加量（C）為自變量，四甲基吡嗪含量（Y）為響應值，采用Box-Behnken 試驗設計，響應面試驗因素及水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

1.3.6 數據處理

實驗數據利用Microsoft office Excel 2016進行統計分析，利用Origin 2018進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 產四甲基吡嗪菌株的分離及篩選

從高溫大曲中共分離獲得103株疑似芽孢桿菌，利用HPLC法測定各菌株發酵上清液中的四甲基吡嗪含量，結果發現其中59株菌可以以葡萄糖為底物發酵產四甲基吡嗪，結果見表2。由表2可知，菌株1-13的四甲基吡嗪含量最高，為112.26 mg/L，因此確定其為后續的試驗菌株。

表2 篩選菌株發酵液中四甲基吡嗪含量的檢測結果Table 2 Determination results of tetramethylpyrazine contents in fermentation broth of screening strains

2.2 菌株1-13的分子生物學鑒定

基于16S rDNA基因序列，構建菌株1-13的系統發育樹，結果見圖1。由圖1可知，菌株1-13與解淀粉芽孢桿菌（Bacillusamyloliquefaciens）聚于一支，親緣關系最近。因此，將菌株1-13鑒定為解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）。

圖1 基于16S rDNA基因序列菌株1-13的系統發育樹Fig.1 Phylogenetic tree of strain 1-13 based on 16S rDNA gene sequences

2.3 菌株1-13產四甲基吡嗪發酵條件優化單因素試驗

2.3.1 初始pH值對菌株1-13產四甲基吡嗪的影響

pH在發酵過程中影響著微生物的生長及四甲基吡嗪的含量，初始pH值對菌株1-13產四甲基吡嗪的影響見圖2。由圖2可知，隨著初始pH值的升高，四甲基吡嗪及乙偶姻產量整體呈先升高后下降的趨勢，當初始pH值為7.0時，四甲基吡嗪及乙偶姻產量均達到最高，分別為125.48 mg/L、854.12 mg/L。菌株1-13的OD600nm值受初始pH值的影響較小。當初始pH值為8.0時，發酵液中的殘糖含量較高，這可能是因為較為極端的pH影響菌株1-13糖代謝所致。結果表明，中性條件下，乙偶姻與銨離子反應生成四甲基吡嗪的轉化率和產量最高。ZHU B等[26]研究發現，當pH值為5.5時枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）發酵獲得最大乙偶姻積累量，再調節pH值至7.0時，實現了乙偶姻向四甲基吡嗪的含量的轉化，與本研究結果略有不同，分析原因可能是不同微生物代謝產生四甲基吡嗪的最適生長pH不同。因此，確定最優初始pH值為7.0。

圖2 初始pH值對菌株1-13發酵產四甲基吡嗪的影響Fig.2 Effect of initial pH on tetramethylpyrazines produced by strain 1-13 fermentation

2.3.2 發酵溫度對菌株1-13產四甲基吡嗪的影響

發酵溫度對菌株1-13產四甲基吡嗪的影響見圖3。由圖3可知，四甲基吡嗪及乙偶姻產量均隨著發酵溫度的升高呈先升高后下降的趨勢，OD600nm值呈下降的趨勢，殘糖量呈先升高后下降而后上升的趨勢。當發酵溫度為40 ℃時，四甲基吡嗪及乙偶姻含量均達到最大值，分別為132.06 mg/L、794.12 mg/L，OD600nm值為1.74，殘糖量為7.63 g/L。有研究表明，從乙偶姻到四甲基吡嗪的反應是自發的非酶催化反應，高溫有利于乙偶姻和氨生成四甲基吡嗪。因此，利用溫度二階段調控能夠有效提高四甲基吡嗪的產量[27]。綜上，確定最優的發酵溫度為40 ℃。

圖3 發酵溫度對菌株1-13發酵產四甲基吡嗪的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on tetramethylpyrazines produced by strain 1-13 fermentation

2.3.3 銨鹽添加量對菌株1-13產四甲基吡嗪的影響

研究表明添加銨鹽對四甲基吡嗪生成速率和產量有重要影響[27]。經預試驗發現菌株1-13在發酵第6天時乙偶姻的含量最高，因此，選擇在發酵第6天時添加銨鹽。銨鹽添加量對菌株1-13產四甲基吡嗪的影響見圖4。

圖4 銨鹽對菌株1-13發酵產四甲基吡嗪的影響Fig.4 Effect of ammonium salt on tetramethylpyrazines produced by strain 1-13 fermentation

由圖4可知，隨著銨鹽添加量的增加，四甲基吡嗪及乙偶姻產量均呈先增加后減少的趨勢。當銨鹽添加量為50.0g/L時，四甲基吡嗪含量達到最大值為155.08 mg/L。當銨鹽添加量為40g/L時，乙偶姻含量達到最大值為548.92 mg/L。分析原因可能是，當銨鹽添加量為20～40 g/L時，磷酸氫二銨作為緩沖溶液，使得發酵液的pH值趨于穩定，負責合成乙偶姻的乙酰乳酸合成酶被激活，乙偶姻的含量增加。當銨鹽添加量＞50.0 g/L之后，四甲基吡嗪產量不再增加，這是因為前體物質乙偶姻含量不足以支持四甲基吡嗪合成。OD600nm值隨著銨鹽添加量的增加而減少，殘糖量隨著銨鹽添加量的增加而增加，原因可能是高濃度的銨鹽抑制了細胞的生長代謝[28]。綜上，確定最優的銨鹽添加量為50 g/L。

2.4 菌株1-13產四甲基吡嗪發酵工藝優化響應面試驗

2.4.1 響應面試驗設計及結果

在單因素試驗結果基礎上，以影響菌株1-13發酵產四甲基吡嗪含量最主要的三個因素發酵溫度（A）、初始pH值（B）、銨鹽添加量（C）為響應變量，四甲基吡嗪含量（Y）為響應值，采用Box-Behnken設計進行響應面試驗，試驗設計及結果見表3，方差分析結果見表4。

表3 Box-Behnken試驗設計及結果Table 3 Design and results of Box-Behnken experiments

表4 回歸模型的方差分析結果Table 4 Results of variance analysis of the regression model

續表

采用Design-ExpertV8.0.6軟件對表3試驗結果進行多元回歸擬合分析，得到四甲基吡嗪含量對各因素的二次回歸方程：Y=167.39-12.64A+12.53B+0.99C+8.83AB-0.89AC-4.89BC-38.85A2-64.26B2-28.87C2。

由表4可知，該模型的P＜0.01，極顯著，失擬項P=0.081 2＞0.05，不顯著，表明模型可較好地擬合試驗情況。決定系數R2=0.981 6，擬合性良好，說明98.16%的四甲基吡嗪產量變化可以用此回歸模型解釋，可較好反映出四甲基吡嗪與發酵溫度、初始pH值、銨鹽添加量之間的關系。調整決定系數R2Adj=0.958 0，說明四甲基吡嗪產量有95.80%受試驗因素影響。綜上所述，以四甲基吡嗪為響應值建立的四甲基吡嗪最佳發酵工藝模型，可對四甲基吡嗪產量進行分析和預測。由表中P值可知，初始pH值和發酵溫度對四甲基吡嗪產量的影響極顯著（P＜0.01），銨鹽添加量對四甲基吡嗪產量的影響不顯著（P＞0.05），二次項對結果影響極顯著（P＜0.01），交互項對結果影響不顯著（P＞0.05）；由F值可知，各因素對四甲基吡嗪產量的影響程度為A＞B＞C，即發酵溫度＞初始pH值＞銨鹽添加量。

2.4.2 響應面交互效應分析

根據回歸方程繪制響應面和等高線，發酵溫度、初始pH值、銨鹽添加量的兩兩交互作用對四甲基吡嗪產量的影響見圖5。

圖5 各因素間交互作用對菌株1-13產四甲基吡嗪影響的響應面及等高線Fig.5 Response surface plots and contour lines of interaction between each factor on tetramethylpyrazine production by strain 1-13 fermentation

由圖5可知，響應面開口向下，等高線為橢圓形，表明各因素間有交互作用，但交互作用不顯著，與方差分析結果一致。

2.4.3 響應面驗證試驗

根據試驗結果和模型分析，得到菌株1-13發酵產四甲基吡嗪的最佳工藝參數為：發酵溫度39.23 ℃、初始pH值7.04、銨鹽添加量50.12 g/L（發酵第6天時添加）。在此條件下四甲基吡嗪產量預測值為168.90 mg/L。為了便于實際操作，將發酵條件調整為發酵溫度39.0 ℃、初始pH值7.0、銨鹽添加量50.0 g/L（發酵第6天時添加），在此條件下發酵10 d，四甲基吡嗪產量實際值為（166.19±2.79）mg/L，與理論值偏差為1.60%，說明此模型能夠用于本研究中，四甲基吡嗪產量比優化前提高48%。

3 結論

本研究以高溫大曲為試驗樣品，篩選獲得以葡萄糖為發酵底物高產四甲基吡嗪的菌株1-13，經鑒定為解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）。通過單因素試驗及響應面試驗優化確定其產四甲基吡嗪的最優發酵工藝為初始pH值7.0、發酵溫度39.0 ℃、接種量5.0%、裝液量20.0%、搖床轉速180 r/min、銨鹽添加量50.0 g/L（發酵第6天時添加），在此優化條件下，四甲基吡嗪產量可達（166.19±2.79）mg/L，較優化前提高48%。此研究為解淀粉芽孢桿菌產四甲基吡嗪的應用提供理論基礎，促進微生物產四甲基吡嗪生產實現工業化應用。