不同形態(tài)外源硒元素對(duì)白酒酒醅菌群的影響

馬葉勝，王艷麗*，周鵬磊，何宏魁，曹潤(rùn)潔，馬金同，李靜心，秦黎明，李安軍

（1.安徽瑞思威爾科技有限公司，安徽 亳州 236800；2.安徽古井貢酒股份有限公司，安徽 亳州 236800）

硒是人體和動(dòng)物所必需的微量元素，也是生物體中硒蛋白質(zhì)和抗氧化物酶的重要組成成分[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，硒在人體抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、預(yù)防心血管疾病、抗病毒、抗衰老、抗癌等方面均具有重要作用[3]。我國屬于嚴(yán)重缺硒國家，人體硒攝入量明顯低于衛(wèi)生組織推薦的最低的攝入量[4]。已知硒的存在主要包含有機(jī)硒和無機(jī)硒兩種形態(tài)，無機(jī)硒一般多指亞硒酸鈉和硒酸鈉，不易被人體吸收，且有較大的毒性，不適合人體和動(dòng)物食用。有機(jī)硒主要包括以硒蛋白、含硒氨基酸為代表的生物合成硒類和以硒醚、二硒醚、有機(jī)硒雜環(huán)化合物等為代表的化學(xué)合成硒類，與無機(jī)硒相比，有機(jī)硒具有生物利用度高，生物活性強(qiáng)，毒副作用小等特點(diǎn)[5]。

硒對(duì)微生物同樣具有一定的毒副作用，微生物則通過吸收環(huán)境中的無機(jī)硒并合成有機(jī)硒從而降低其毒性，同時(shí)也因?yàn)槲⑸镂牡投疽孜帐抢硐氲奈囱a(bǔ)充劑。白酒釀造過程是一種自然接種、多菌種的復(fù)合發(fā)酵過程，釀造過程中微生物可以把無機(jī)硒轉(zhuǎn)化為硒蛋白、硒多糖等有機(jī)硒從而降低其毒性[6]。

關(guān)于硒對(duì)白酒就酒醅菌群的影響，國內(nèi)暫無相關(guān)研究。目前在硒和白酒相互領(lǐng)域的研究方面，主要是通過富硒原料和富硒微生物發(fā)酵應(yīng)用來實(shí)現(xiàn)[7]。但李勤等[8]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)硒質(zhì)量濃度超過一定范圍（＞5 mg/L）會(huì)抑制根霉和酵母的生長(zhǎng)，同樣細(xì)菌的生長(zhǎng)也受硒質(zhì)量濃度的影響，一定的硒質(zhì)量濃度對(duì)于細(xì)胞的正常生長(zhǎng)及其生物活性至關(guān)重要，而當(dāng)硒質(zhì)量濃度＞10 mg/L時(shí)，就主要表現(xiàn)為毒性作用[9]。

本研究以二氫楊梅素（dihydromyricetin-selenium，DMS）硒化合物作為二硒醚類的有機(jī)硒代表，以亞硒酸鈉作為無機(jī)硒代表，通過對(duì)特定含量（5 mg/kg）的不同形態(tài)硒元素對(duì)白酒酒醅菌群結(jié)構(gòu)的影響進(jìn)行研究，初步評(píng)價(jià)外源硒的添加對(duì)白酒酒醅微生物的影響，為后續(xù)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

二氫楊梅素硒（DMS）：上海愛啟醫(yī)藥技術(shù)有限公司；亞硒酸鈉：山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司；酒醅：從濃香型白酒實(shí)驗(yàn)車間獲取。

MoBio 強(qiáng)力土壤提取試劑盒：德國QIAGEN公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）2×預(yù)混液：南京諾唯贊生物科技有限公司；Agencourt AMPure XP核酸純化試劑盒：美國Beckman Coulter公司；Ultra II 脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）文庫制備試劑盒：美國NEB公司；文庫定量試劑盒：美國KAPA公司；MiSeq Reagent Kit v3基因測(cè)序試劑盒：美國Illumina公司。

1.2 儀器與設(shè)備

3141型三氣培養(yǎng)箱、5906型超低溫冷凍冰箱、ABI 9700 PCR儀、ABI StepOnePlus實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)：美國ThermoFisher科技公司；LabChip GX Touch HT微流控毛細(xì)管電泳系統(tǒng)：美國PerkinElmer公司；2100型生物分析儀：安捷倫科技有限公司；MiSeq高通量二代測(cè)序儀：美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 酒醅發(fā)酵及取樣方法

從濃香型生產(chǎn)車間取入池前酒醅，分為12份，每份（800±10）g：其中2份酒醅未做任何處理作為空白對(duì)照，標(biāo)記為CK1、CK2；5份酒醅均勻噴灑有機(jī)硒溶液使硒元素最終含量為5 mg/kg[8]，標(biāo)記為Or_Se1、Or_Se2、Or_Se3、Or_Se4和Or_Se5；5份酒醅均勻噴灑無機(jī)硒（亞硒酸鈉）溶液使硒元素最終含量為5 mg/kg，標(biāo)記為In_Se1、In_Se2、In_Se3、In_Se4和In_Se5；分別裝在1.5 L瓶口設(shè)有發(fā)酵栓的玻璃瓶中，然后于培養(yǎng)箱中30 ℃恒溫進(jìn)行封閉發(fā)酵20 d，發(fā)酵結(jié)束后，去除瓶中上層1/3的酒醅，其余酒醅混合后進(jìn)行取樣，-80 ℃保存。

1.3.2 酒醅微生物多樣性檢測(cè)

將酒醅樣品在干冰保護(hù)下送于北京奧維森基因科技有限公司，提取酒醅樣品的總基因組脫氧核糖核酸（DNA），確定合格后，以其為模板進(jìn)行細(xì)菌和真菌PCR擴(kuò)增，其中細(xì)菌擴(kuò)增16S rRNA基因的V3-V4區(qū)，真菌擴(kuò)增ITS rDNA的ITS2區(qū)，細(xì)菌PCR擴(kuò)增體系及參數(shù)參考文獻(xiàn)[10]，真菌PCR擴(kuò)增體系和擴(kuò)增條件參考文獻(xiàn)[11]。使用生物分析儀檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，并用Agencourt AMPure XP核酸純化試劑盒純化。利用純化后的PCR產(chǎn)物構(gòu)建微生物多樣性測(cè)序文庫，確定DNA文庫合格，采用Illumina Miseq PE300高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行Paired-end測(cè)序。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

下機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)過QIIME1（v1.8.0）[12]軟件根據(jù)Barcode序列拆分樣本，使用Pear（v0.9.6）[13]軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾、拼接；然后使用Vsearch（v2.7.1）[14]軟件去除長(zhǎng)度＜120 bp的序列，并根據(jù)Unite數(shù)據(jù)庫用uchime方法[15-16]比對(duì)去除嵌合體序列。使用Vsearch（v2.7.1）軟件uparse算法對(duì)優(yōu)質(zhì)序列按照相似度97%進(jìn)行操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類。與Unite數(shù)據(jù)庫使用基本局部比對(duì)搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）算法進(jìn)行比對(duì)，對(duì)OTU進(jìn)行注釋。再利用QIIME1（v1.8.0）軟件進(jìn)行α多樣性指數(shù)分析（包括Shannon和Chao1等指數(shù)）?；谖锓N注釋及相對(duì)豐度結(jié)果，使用軟件R（v3.6.0）進(jìn)行物種組成柱狀圖分析。使用QIIME1（v1.8.0）計(jì)算beta多樣性距離矩陣，使用R軟件對(duì)Unweighted的UniFrac距離矩陣[17]進(jìn)行非度量多維尺度（nonmetric multidimensional scaling，NMDS）分析（R3.3.2），并對(duì)豐度靠前屬進(jìn)行聚類分析并繪制熱圖。柱狀圖由Origin2018完成，差異顯著性分析通過SPSS 25.0方差分析（analysis of variance，ANOVA）實(shí)現(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒醅微生物菌群的α-多樣性

Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)分別用于評(píng)估樣品中微生物的豐度與其群落多樣性，分析外源添加不同形態(tài)硒元素酒醅樣品的細(xì)菌和真菌α-多樣性，結(jié)果見表1。

表1 酒醅微生物菌群的α多樣性Table 1 Alpha-diversity of microbial flora in fermented grains

由表1可知，酒醅樣品細(xì)菌和真菌測(cè)序覆蓋率均為100%，說明測(cè)序結(jié)果能完整反映酒醅的微生物群落組成信息。細(xì)菌α-多樣性方面，與CK相比，Or_Se酒醅樣中OTUs數(shù)目和Shannon指數(shù)略有升高，但不顯著（P＞0.05），Chao1指數(shù)則顯著降低（P＜0.05）；而In_Se酒醅樣中OTUs數(shù)目和Shannon指數(shù)均顯著提高（P＜0.05），Chao1指數(shù)則無明顯變化。真菌α-多樣性結(jié)果表明，與CK相比，Or_Se和In_Se酒醅樣中的OTUs數(shù)目、Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)均略有降低，但無顯著差異（P＞0.05），與已知在硒質(zhì)量濃度≥5 mg/L時(shí)對(duì)根霉和酵母等真菌均具有抑制作用，結(jié)論基本一致[8]。表明當(dāng)硒含量為5 mg/kg時(shí)，不管是有機(jī)硒還是無機(jī)硒均對(duì)酒醅發(fā)酵過程中真菌數(shù)量、多樣性和豐富度有一定的抑制，但抑制程度不明顯；而對(duì)細(xì)菌多樣性和數(shù)量則有促進(jìn)作用，尤其是無機(jī)硒的添加對(duì)細(xì)菌促進(jìn)作用明顯。這與樊俊等[18]研究外源添加5 mg/kg的無機(jī)硒對(duì)土壤細(xì)菌和真菌數(shù)量的增加均有促進(jìn)作用，略有不同。

2.2 酒醅微生物菌群的β-多樣性分析結(jié)果

2.2.1 優(yōu)勢(shì)菌門組成

添加不同形態(tài)硒元素的酒醅中基于門水平的細(xì)菌及真菌群落結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 基于門水平添加不同形態(tài)硒元素的酒醅中的細(xì)菌（A）及真菌（B）群落結(jié)構(gòu)Fig.1 Community structure of bacteria (A) and fungi (B) in fermented grains with different forms of selenium addition based on phylum level

由圖1A可知，酒醅樣品中存在6個(gè)細(xì)菌門，其中相對(duì)豐度＞1%的優(yōu)勢(shì)菌門有3個(gè)，包括厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteria），均對(duì)硒具有還原作用[19]。酒醅樣CK、Or_Se和In_Se中，均是厚壁菌門為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌門（分別占99.55%、95.69%和95.00%），與胡曉龍等[20]研究發(fā)現(xiàn)酒醅發(fā)酵15～60 d厚壁菌門為唯一優(yōu)勢(shì)菌門結(jié)論一致；變形菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteria）在Or_Se和In_Se酒醅樣中轉(zhuǎn)為優(yōu)勢(shì)菌門（相對(duì)豐度＞1%）。說明外源添加有機(jī)硒或無機(jī)硒利于酒醅發(fā)酵過程中Proteobacteria和Actinobacteria豐度的積累。

由圖1B可知，酒醅樣CK、Or_Se和In_Se中存在2個(gè)真菌門，分別為子囊菌門（Ascomycota）和毛霉菌門（Mucoromycota），其中子囊菌門為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌門（分別占95.25%、95.99%和95.42%），其次是毛霉菌門（分別占4.55%、3.86%和4.34%），這與已知濃香型出池酒醅以及富硒礦區(qū)土壤中均是以子囊菌門為優(yōu)勢(shì)真菌結(jié)論一致[21-22]。酒醅樣CK、Or_Se和In_Se中子囊菌門和毛霉菌門兩真菌門相對(duì)豐度基本一致，說明外源添加有機(jī)硒或無機(jī)硒對(duì)酒醅發(fā)酵過程中真菌門組成無影響，與表2結(jié)論基本一致。

2.2.2 優(yōu)勢(shì)菌屬組成

添加不同形態(tài)硒元素的酒醅中基于屬水平的細(xì)菌及真菌群落結(jié)構(gòu)組成見圖2。

圖2 基于屬水平添加不同形態(tài)硒元素的酒醅中細(xì)菌（A）及真菌（B）群落結(jié)構(gòu)Fig.2 Community structure of bacteria (A) and fungi (B) in fermented grains with different forms of selenium addition based on genus level

由圖2A可知，共得到6個(gè)主要細(xì)菌屬，其中相對(duì)豐度＞1%的優(yōu)勢(shì)屬有4個(gè)，包括乳桿菌屬（Lactobacillus）、醋桿菌屬（Acetobacter）、克羅彭斯特菌屬（Kroppenstedtia）和魏斯氏菌屬（Weissella）。CK、Or_Se和In_Se酒醅樣中，均是乳桿菌屬（Lactobacillus）為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬（97.19%、92.86%和88.81%），其次是醋桿菌屬（0.10%、3.53%和2.43%）、克羅彭斯特菌屬（0.80%、0.77%和2.12%）和魏斯氏菌屬（0.37%、0.54%和1.15%）。與CK酒醅樣相比，加硒酒醅樣中的乳桿菌屬相對(duì)豐度明顯降低，這與已有研究[23-24]在一定硒濃度條件下不具有富硒功能的乳桿菌生長(zhǎng)會(huì)受到抑制，結(jié)論一致。而加硒酒醅樣中的醋桿菌屬相對(duì)豐度則明顯增加，可能與醋桿菌屬的硒耐受性較高有關(guān)[25]；此外加無機(jī)硒酒醅樣中克羅彭斯特菌屬和魏斯氏菌屬的相對(duì)豐度也明顯增加。推測(cè)外源添加有機(jī)硒或無機(jī)硒由于降低了酒醅發(fā)酵過程乳桿菌屬的優(yōu)勢(shì)地位，促進(jìn)了其他菌屬的生長(zhǎng)，進(jìn)而增加了物種多樣性。

由圖2B可知，共得到10個(gè)真菌屬，其中在酒醅樣CK、Or_Se和In_Se中豐度占比前4的優(yōu)勢(shì)屬均為酵母菌類，包括Kazachstania屬、釀酒酵母屬（Saccharomyces）、覆膜酵母屬（Saccharomycopsis）和伊薩酵母屬（Issatchenkia），總占比分別為88.42%、87.38%和82.84%。然后是霉菌類，包括根霉屬（Rhizopus）、Rasamsonia屬、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）、雙足囊菌屬（Dipodascus）和曲霉屬（Aspergillus），總占比分別為9.75%、11.17%和13.70%。各酵母菌屬與各霉菌屬在酒醅樣CK、Or_Se和In_Se中的豐度占比基本一致，說明添加有機(jī)硒或無機(jī)硒對(duì)酒醅發(fā)酵過程中真菌屬的組成無明顯影響，與表1和圖1B結(jié)論一致。

2.3 不同形態(tài)硒元素對(duì)酒醅菌群影響比較

為了說明外源添加不同形態(tài)硒元素的酒醅發(fā)酵過程中物種組成的相似性情況，對(duì)酒醅樣CK、Or_Se和In_Se中細(xì)菌及真菌的OTU進(jìn)行韋恩圖繪制，結(jié)果見圖3。由圖3可知，在OTUs組成上，細(xì)菌群落中分別得到1、14和112個(gè)特有OTU，共有OTU數(shù)為86個(gè)（圖3A）；真菌群落分別得到2、13和19個(gè)特有OTU，共有OTU數(shù)為91個(gè)（圖3B）。除酒醅樣CK外，酒醅樣Or_Se和In_Se中細(xì)菌種類多于真菌種類，尤其是酒醅樣In_Se，說明外源添加無機(jī)硒利于促進(jìn)酒醅發(fā)酵過程中細(xì)菌種類的提高，與表1結(jié)論一致。

圖3 基于OTU添加不同形態(tài)硒元素的酒醅中細(xì)菌（A）及真菌（B）韋恩圖Fig.3 Venn diagrams of bacteria (A) and fungi (B) in fermented grains with different forms of selenium addition based on OTU

基于屬水平，對(duì)12個(gè)酒醅樣本的細(xì)菌和真菌菌群分別進(jìn)行非度量多維尺度（NMDS）聚類分析，結(jié)果見圖4。橢圓代表本組（同顏色）數(shù)據(jù)的95%置信水平，兩圖的脅強(qiáng)系數(shù)（stress index）均＜0.1，表示數(shù)據(jù)擬合較好。圖中酒醅樣本之間的距離代表了酒醅菌群之間的差異程度，距離越近，樣本菌群組成越相似。由圖4可知，在細(xì)菌（圖4A）和真菌（圖4B）的NMDS圖上，所有酒醅樣距離均較近，說明各酒醅樣細(xì)菌及真菌群落組成相似。

圖4 基于屬水平添加不同形態(tài)的硒元素的酒醅中細(xì)菌（A）及真菌（B）的非度量多維尺度分析結(jié)果Fig.4 Non-metric multidimensional scaling analysis results of bacteria(A)and fungi(B)in fermented grains with different forms of selenium addition based on genus level

基于屬水平，進(jìn)一步比較酒醅樣CK、Or_Se和In_Se群落組成的相似性和差異性，根據(jù)酒醅樣品屬水平的物種注釋和豐度信息，選取相對(duì)豐度＞0.5%優(yōu)勢(shì)菌屬進(jìn)行差異聚類分析，得到聚類熱圖，結(jié)果見圖5。

圖5 基于屬水平細(xì)菌（A）及真菌（B）群落物種相對(duì)豐度聚類熱圖Fig.5 Clustering heat map of relative abundance of bacterial (A)and fungal (B) communities based on genus level

由圖5A可知，酒醅樣CK和Or_Se聚類在一起，而酒醅樣In_Se單獨(dú)分開，說明酒醅樣CK和Or_Se在細(xì)菌屬組成上更接近，且與酒醅樣In_Se差異明顯。酒醅樣CK中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬乳桿菌屬（Lactobacillus）相對(duì)偏高，酒醅樣Or_Se的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬醋桿菌屬相對(duì)偏高，酒醅樣In_Se的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為芽孢桿菌屬、克羅彭斯特菌屬、枝芽孢桿菌屬（Virgibacillus）和魏斯氏菌屬（Weissella）相對(duì)偏高。

由圖5B可知，與圖5A結(jié)果一致，酒醅樣CK和Or_Se聚類在一起，而酒醅樣In_Se單獨(dú)分開，說明酒醅樣CK和Or_Se在真菌屬組成上也更接近，且與酒醅樣In_Se差異明顯。在酒醅樣CK、Or_Se和In_Se中的組成聚類分析結(jié)果表明，三組樣品在優(yōu)勢(shì)真菌屬上差異明顯，Rasamsonia、Kazachstania和酵母屬在酒醅樣Or_Se中相對(duì)豐度偏高，嗜熱子囊菌屬、曲霉屬、伊薩酵母屬和雙足囊菌屬（Dipodascus）在酒醅樣In_Se中相對(duì)豐度偏高；覆膜酵母屬、根霉屬（Rhizopus）和畢赤酵母屬（Pichia）在酒醅樣CK中相對(duì)豐度偏高。

白酒酒醅細(xì)菌和真菌菌屬群落結(jié)構(gòu)上差異不大，但各類菌屬在不同樣品中相對(duì)豐度都存在一定的差異，樣品CK和Or_Se細(xì)菌和真菌群落有較高的相似度，但其第一大優(yōu)勢(shì)菌屬發(fā)生了演替，CK中的細(xì)菌第一大優(yōu)勢(shì)菌屬乳酸桿菌屬，在Or_Se中演替為醋桿菌，CK中的真菌第一大優(yōu)勢(shì)菌屬覆膜酵母屬，在Or_Se中演替為Rasamsonia，而酒醅樣In_Se區(qū)別于其它酒醅樣品，In_Se中第一大優(yōu)勢(shì)細(xì)菌芽孢桿菌屬和真菌嗜熱子囊菌屬在CK和Or_Se中均不占第一大優(yōu)勢(shì)，說明外源添加有機(jī)和無機(jī)硒都導(dǎo)致酒醅微生物群落發(fā)生了演替，且添加無機(jī)硒造成的酒醅微生物群落演替更明顯。

3 結(jié)論

本研究通過高通量測(cè)序技術(shù)分析了外源添加5 mg/kg有機(jī)和無機(jī)硒對(duì)發(fā)酵酒醅中微生物群落多樣性及優(yōu)勢(shì)菌分布的影響。研究結(jié)果表明，外源硒的添加對(duì)酒醅中細(xì)菌和真菌微生物多樣性均產(chǎn)生了一定的影響。樣品α-多樣性結(jié)果表明，外源硒的添加對(duì)酒醅中細(xì)菌群落影響較大；樣品β-多樣性結(jié)果表明，外源硒的添加會(huì)導(dǎo)致酒醅細(xì)菌和真菌微生物群落發(fā)生演替，且造成的細(xì)菌微生物群落演替更明顯；樣品NMDS聚類和微生物菌群熱圖聚類結(jié)果表明，添加無機(jī)硒造成的酒醅微生物群落演替更明顯。綜上，白酒酒醅細(xì)菌菌群更易受外源硒的影響發(fā)生群落演替，且白酒酒醅微生物多能利用無機(jī)硒促進(jìn)微生物群落發(fā)生演替，本文為后續(xù)白酒富硒微生物的研究提供了研究方向和理論支撐。