影響廣東米香白酒飲后代謝與舒適度的關鍵酒體風味成分研究

劉 雅，皇甫潔，何松貴，方毅斐，關美玲，何猛超，王德良，4*，吳振強

（1.新疆農業大學 食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊 830052；2.中國食品發酵工業研究院有限公司，北京 100015；3.廣東省九江酒廠有限公司，廣東 佛山 528203；4.科技部國家酒類品質與安全國際聯合研究中心，北京 100015；5.華南理工大學 生物科學與工程學院，廣東 廣州 510641）

廣東米香白酒具有“玉潔冰清，豉香獨特，醇和甘滑，余味爽凈”的特點[1]，因其用小曲生產，先固態培菌糖化，然后加水進行半液態發酵，故在釀造中微生物不僅作為釀造的發酵源，還能產多種風味化合物。根據其化學屬性的不同，可以將白酒中的微量成分分為醇類、醛類、酸類、酯類以及其他類化合物[2-4]。醇類物質增加白酒綿甜和香氣，起到增香增甜及調和的作用，但是當白酒中的醇類物質過高時，不僅會影響白酒的風味，還會在酒后產生不良反應，影響身心健康[5]；醛類物質為白酒提供了刺激味和辛辣味，經常灌胃含游離狀態乙醛的酒，對人體有強烈的刺激性，也能促進中樞血管收縮，從而心跳加速，血壓上升，使人頭暈腦脹，因此乙醛形成“酒癮”在人體內蓄積，損害人體中樞神經的原因之一[6-7]；酒中酸味是由氫離子提供的，適量的酸可對酒起緩沖作用，并在貯存過程中能緩慢地形成香酯而酯類化合物在白酒中不僅起到呈香呈味的作用，還可以加速乙醇、乙醛在人體內的代謝，灌胃者不易昏醉和上頭[8-9]；酯類物質和酸構成的比例也是影響上頭的重要因素之一[10]。

目前，許多研究報道了白酒中的微量成分對白酒飲后代謝與舒適度影響。邱修柄[11]運用氣相色譜（gas chromatography，GC）檢測到梅州地區米香型白酒上頭主要受雜醇油、醛類、酯類及酸的影響，異丁醇的危害程度是乙醇的8倍，而異戊醇的危害程度是乙醇的19倍，確定了異丁醇和異戊醇是導致廣東米香白酒上頭的重要原因。余潔瑜等[12]也指出，乙醛能夠刺激人體的中樞神經系統，促進腦細胞收縮甚至痙攣，其毒性大約是乙醇的10倍。謝佳等[13]通過模擬豉香型白酒特征組分的組成而制備配制酒，對其進行醉度評價，結果揭示了合適的異戊醇、酸、酯比例可有效降低醉度；異戊醇對醉度具有雙向作用，這主要取決于異戊醇、酸、酯配比。

為了探討影響廣東米香白酒飲后代謝與舒適度的關鍵成分，通過動物行為學和酒精代謝生物標志物，對4款市售廣東米香白酒飲后代謝與舒適度進行評價，結合酒體成分主成分分析（principal component analysis，PCA）分析影響廣東米香白酒代謝與舒適度的關鍵成分。同時結合灌胃后小鼠自主行為變化以及酒精代謝程度的比較研究，確定影響廣東米香白酒飲后代謝與舒適度的關鍵物質，以期為提高廣東米香白酒飲后代謝與舒適度提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗樣品和實驗動物

四款廣東米香白酒（酒樣A（40%vol）、酒樣B（40%vol）、酒樣C（40%vol）、酒樣D（40%vol））：市售。

50日齡的雄性C57/BL21小鼠（體質量平均為（20±2）g）：斯貝福（北京）生物技術有限公司，實驗前于清潔Ⅱ級環境進行一周適應性飼養。

1.1.2 化學試劑

異戊醇、乳酸：天津市福星化學試劑有限公司；異丁醇、己酸乙酯：北京百靈威科技有限公司；正丙醇、乳酸乙酯、丁酸乙酯：上海晶純生化科技股份有限公司；活性戊醇：上海安普實驗科技股份有限公司；2,3-丁二醇、乙醛、糠醛：比利時Acros公司；己酸：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；乙酸：天津市致遠化學試劑有限公司；乙酸乙酯：北京北化精細化學品有限責任公司。實驗所用試劑均為色譜純或分析純。

1.2 儀器與設備

曠場實驗動物行為學跟蹤系統（ANY-Maze系統）：美國Stoelting公司；Clarus-SQ氣質聯用（gaschromatography-mass spectrometer，GC-MS）儀：美國PerkinElmer公司；Clarus 580氣相色譜（GC）儀（配備氫火焰離子化檢測器（flame ionization detector，FID））、Scimtific Forna 900超低溫冰箱：美國熱電公司；DHG-9162電熱恒溫培養箱：上海一恒科技有限公司；J&W-GC型硅烷化玻璃微球色譜柱（30 m×0.53 mm×1.00 m）：美國Agilent公司；Multiskan FC型酶標儀：美國Thermo公司；Milli-Q Gradien超純水系統：美國Millipore公司SW-CJ-1F潔凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組

根據廣東米香白酒酒體內風味物質的含量選取200 mg/kg、500 mg/kg、800 mg/kg、1 000 mg/kg四個質量濃度進行風味成分酒精灌胃，實驗共分為如下幾組：①酒樣灌胃實驗組：分別灌胃4款廣東米香白酒；②空白灌胃對照組：灌胃去離子水（安慰劑）；③食用酒精灌胃對照組：灌胃40%vol食用酒精；④風味成分酒精灌胃實驗組：灌胃體積分數40%vol食用酒精配制200 mg/kg、500 mg/kg、800 mg/kg、1 000 mg/kg風味成分溶液。

1.3.2 灌胃劑量

根據《2019年美國肝病學會臨床指南：酒精相關性肝病的診斷和治療》[14]對酒精性肝病的人體每日酒精攝入最大劑量建議，同時結合我國飲酒人群的日常飲酒量統計學數據，以人體每日攝入純酒精量為60 g/kg體質量為參照，與小鼠的等效藥理學劑量進行折算出每只小鼠每日純酒精攝入劑量為7.8 g/kg體質量，根據所用酒樣的酒精度（40%vol），計算出每只動物每天灌胃白酒和食用酒精劑量為0.3 mL/只。

1.3.3 曠場實驗方法

根據1.3.1中的實驗分組，每組小鼠對應一種實驗酒樣，將每組小鼠依次在灌酒前0 h、灌酒后2 h分別置于空地上的實驗動物行為跟蹤系統，實時記錄并同時分析灌酒前0 h、灌酒后2 h小鼠自由運動120 s的行動軌跡作為行為參數。實驗操作過程中保持安靜，每只動物在實驗結束后及時清理，以減少之前動物的氣味，防止行為干擾。

1.3.4 主成分分析法

主成分分析（principal component analysis，PCA）是利用降維的思想，將多個相互關聯的變量轉化為幾個不相關的綜合指標，即找到幾個主成分，使其盡可能多地保留原有變量的信息，且相互不相關，是一種通過線性轉換為一組不相關的變量，簡化原有多維問題的數學轉換方法[15-18]。本實驗采用SPSS 26.0軟件對上述物質成分進行主成分分析，將醇類、醛類、酸類、酯類每一類的累計方差貢獻率達到93%且特征根＞1的成分定義為主成分。

1.3.5 酒體風味成分檢測

風味成分測定采用氣質聯用法。GC條件：純度＞99.999%的高純氦氣（He）為載氣，CF-Wax57CB毛細管色譜柱（25 m×0.25 mm×0.2 μm）的起始柱溫35 ℃恒溫后繼續升溫至230 ℃，然后不分流進樣；進樣口溫度240 ℃；質譜條件：電子電離（electron ionization，EI）源，離子源溫度230 ℃；采用選擇離子監測（selected ion monitoring，SIM）掃描模式。以乙酸正戊酯（2%）和2-乙基丁酸（2%）作為內標進行半定量。

有機酸測定采用離子色譜法。色譜條件如下：Dionex IonPao AG11-HC分析柱（4 mm×250 mm）；Dionex IonPao AG1I1-HC保護柱（4 mm×50 mm）；淋洗液：超純水；淋洗液流速1.1 mL/min；進樣體積50 μL；色譜池溫度35 ℃；柱溫30 ℃；抑制器電流96 mA。

1.3.6 小鼠血清中乙醇和乙醛含量測定

小鼠灌胃后2h，摘除眼球采集血液標本0.5mL，3500r/min離心15 min，提取上清液作為血清，-80 ℃保存，用于測定乙醇和乙醛含量。

血清中乙醇和乙醛的含量根據中華人民共和國公共安全標準GA/T 842—2009《血液酒精含量的檢驗方法》中的氣相色譜法進行測定[19]，并稍有改進。

待測血清在進樣前稀釋10倍，將1 mL稀釋后的樣品置于頂空瓶中并密封。氣相色譜條件：J&W-GC型硅烷化玻璃微球色譜柱（30 m×0.53 mm×1.00 m）。檢測器溫度250 ℃，進樣口溫度240 ℃，柱溫起始溫度40 ℃，以10 ℃/min升溫至60 ℃，然后以20 ℃/min升溫至120 ℃，以40 ℃/min升溫至215 ℃，頂空溫度55 ℃，加熱時間40 min。載氣：氮氣（N2），流速1mL/min，火焰離子檢測器（FID）。進樣量：1 μL。

1.3.7 數據處理及分析

所有的數據均重復測定5次，實驗結果采用Excel 2019、SPSS Statistics 26.0軟件，使用方差分析（analysis of variance，ANOVA）方法進行統計，圖由Origin Pro 2018繪制。

2 結果與分析

2.1 廣東米香白酒中關鍵酒體成分主成分分析

為進一步判斷酒樣中起重要作用的關鍵酒體成分，通過色譜技術對酒樣A、酒樣B、酒樣C、酒樣D 等4款廣東米香白酒的主要風味物質進行定量分析檢測，結果見圖1。由圖1可知，廣東米香白酒中主要的風味成分中醇類物質主要有異戊醇、異丁醇、正丙醇、活性戊醇以及2,3丁二醇；醛類物質主要有乙醛、乙縮醛和糠醛；有機酸類物質主要有乳酸、乙酸以及己酸；酯類物質主要有丁酸乙酯、乙酸乙酯、己酸乙酯以及乳酸乙酯。對風味物質成分進行主成分分析，結果見圖2。由圖2可知，異丁醇、異戊醇、甲醇、異戊醛、糠醛、乙醛、戊酸、正丁酸、甲酸乙酯、己酸乙酯等微量酒體成分在各自類別的主成分中有較大貢獻度，推測這些成分與影響廣東米香白酒飲后代謝有一定的關聯，為后期探討影響廣東米香白酒飲后代謝的關鍵酒體成分提供理論依據。

圖1 四種廣東米香白酒樣品中風味物質GC-MS分析結果Fig.1 Results of flavor substances in four kinds of Guangdong rice-flavor Baijiu samples analyzed by GC-MS

圖2 四種廣東米香白酒樣品風味物質主成分分析結果Fig.2 Principal component analysis results of flavor substances in four kinds of Guangdong rice-flavor Baijiu samples

2.2 小鼠曠場實驗結果

曠場實驗是動物精細行為中常用到的實驗方法，因為小鼠不僅對開放空間有恐懼和趨避活動的傾向，還會對新的環境產生好奇心去探索，在很多場景下不僅可以模擬人的情緒、動作、活動等方面的特點，而且實驗結果有很高的重復性[20-23]，所以常用圓形或方形的箱子作曠場，小鼠可以自由活動，箱子的頂部裝有攝像頭，記錄小鼠的活動，通過軟件記錄分析小鼠在曠場中的行動軌跡，行動距離、移動時間、停滯時間等參數。經前期實驗發現，多個行為指標中，停滯時間比存在顯著差異，測定其酒精代謝標志物后發現，停滯時間比差異顯著組酒精代謝緩慢，從而影響飲后舒適度。故本試驗選用灌胃后與灌胃前停滯時間比值表示，降低小鼠因個體差異造成的實驗誤差。

在食用酒精中添加不同濃度的不同醇類物質對小鼠灌胃后2 h的行為參數進行統計分析，結果見圖3。由圖3可知，醇類物質中，實驗組酒樣與食用酒精對照組相比，在灌胃后會引起小鼠行為參數下降，灌胃后小鼠行為的抑制程度比食用酒精和其他酒樣明顯增強，表現為適度抑制，其中異丁醇組有抑制作用顯著（P＜0.05），而正丙醇和異戊醇在物質濃度達到800 mg/kg時有顯著抑制作用（P＜0.05），當物質濃度達到1 000 mg/kg時，正丙醇和2,3-丁二醇停滯時間比小于食用酒精對照組，小鼠行為產生促進作用，小鼠表現為適量興奮，但并無顯著作用（P＞0.05），推測醇類物質中異丁醇和異戊醇是影響飲后代謝的關鍵物質。

圖3 小鼠灌胃醇類物質后在曠場中運動的停滯時間比Fig.3 Stagnation time ratio of motion in the open field of mice after intragastric administration of alcohols

在食用酒精中添加不同濃度的不同醛類物質對小鼠灌胃后2 h的行為參數進行統計分析，結果見圖4。由圖4可知，實驗組酒樣與食用酒精對照組相比，在灌胃后會引起小鼠行為參數下降，整體表現為行為抑制狀態，且差異顯著（P＜0.05），其中乙醛組抑制作用有顯著差異（P＜0.05），推測醛類物質中乙醛是影響灌胃后代謝的關鍵物質。

圖4 小鼠灌胃醛類物質后在曠場中運動的停滯時間比Fig.4 Stagnation time ratio of motion in the open field of mice after intragastric administration of aldehydes

食用酒精中添加不同濃度的不同有機酸類物質對小鼠灌胃后2 h的行為參數進行統計分析，結果見圖5。

圖5 小鼠灌胃后有機酸類物質在曠場中運動的停滯時間比Fig.5 Stagnation time ratio of motion in the open field of mice after intragastric administration of organic acid-like substances

由圖5可知，實驗組酒樣與食用酒精對照組相比，各實驗組在灌胃后會引起小鼠行為參數下降，整體表現為行為抑制狀態，其中乳酸在達到500 mg/kg，己酸在達到800 mg/kg時抑制作用顯著（P＜0.05），推測有機酸中乳酸和己酸濃度的高低會影響白酒飲后的代謝。

在食用酒精中添加不同濃度的不同酯類物質對小鼠灌胃后2 h的行為參數進行統計分析，結果見圖6。結果表明，實驗組酒樣與食用酒精對照組相比，在灌胃后會引起小鼠行為參數下降，整體表現為行為抑制狀態，其中乳酸乙酯在200 mg/kg和500 mg/kg時抑制效果顯著，但是己酸乙酯組和丁酸乙酯組在達到500 mg/kg時，灌胃后小鼠行為表現為適度興奮，興奮效果不顯著（P＞0.05）。

圖6 小鼠灌胃酯類物質后在曠場中運動的停滯時間比Fig.6 Stagnation time ratio of motion in the open field of mice after intragastric administration of esters

2.3 小鼠灌胃后血清乙醇和乙醛積累水平分析

血液中與醉酒程度和飲后“上頭”相關的主要生物標志物是乙醇和乙醛[25]。乙醇進入人體后隨血液流經肝臟，首先被乙醇脫氫酶氧化為乙醛，該過程中會導致血液中乙醛的累積，乙醛可在體內積蓄，迫使末梢血管擴張，引起臉部血液的涌漲，并使中樞血管收縮，心跳加速，促使血壓升高，使人頭暈、漲痛，這是白酒飲后上頭的重要原因之一[24-25]。當血液中乙醇濃度超過一定限度時，血流量增加而代謝作用卻下降。這就造成乙醇在腦中不能及時代謝排出，必然會引起頭痛、頭暈。乙醛會使人心跳加速，血壓升高，嗓子發干，頭暈頭痛[26]。

根據曠場實驗結果，異戊醇組、異丁醇組和乙醛組、己酸組以及乙酸乙酯組灌胃后2 h行為參數差異較大，因此本實驗中選用異戊醇組、異丁醇組和乙醛組、己酸組以及乙酸乙酯組對小鼠灌胃后2 h血清乙醇和乙醛含量測定，結果見圖7。結果表明，與食用酒精對照組相比，低濃度異戊醇、乙醛、己酸組實驗組，中低濃度中乙醛組、己酸組，高濃度的活性戊醇、乙醛、乳酸、乙酸組各實驗組中小鼠血清中乙醛積累量高于對照組且乙醛組有顯著差異（P＜0.05），推測是該幾組實驗組小鼠肝臟中乙醛脫氫酶含量不足以將乙醛轉化為乙酸從而導致乙醛在血清中積累。

圖7 小鼠血清乙醇、乙醛含量測定結果Fig.7 Determination results of ethanol and acetaldehyde contents in serum of mice

2.4 成品酒灌胃后小鼠自主行為及血清中乙醇及乙醛積累水平分析

為驗證上述實驗結果，選用從市面所購買的異丁醇和異戊醇含量較高的兩款廣東米香白酒，按照1.3.3中描述的方法，測定小鼠灌胃后2 h在曠場中的行為參數，按照1.3.6測定小鼠血清中乙醇、乙醛含量，實驗結果見圖8。由圖8a可知，與對照組相比，各實驗組酒樣在灌胃后會引起小鼠行為參數下降，灌胃后小鼠行為的抑制程度比食用酒精和其他酒樣明顯增強，表現為適度抑制且抑制作用顯著（P＜0.05）。由圖8b可知，灌胃不同米酒后血清中乙醛的含量變化與2.3中結果一致。從2.1可知，B、D酒樣中異丁醇、異戊醇含量較高。總體分析，異丁醇和異戊醇組灌胃后小鼠對酒精的代謝較低，結合酒后動物自主運動行為參數及行為參數比的分析結果，認為灌胃異丁醇和異戊醇組小鼠行為呈現抑制的狀態。推測酒體成分中異丁醇和異戊醇是影響小鼠灌胃后酒精代謝與乙醛轉化積累的主要原因[22]。

圖8 小鼠灌胃成品酒后在曠場中運動的停滯時間比（a）及血清中乙醇和乙醛含量測定結果（b）Fig.8 Stagnation time ratio of locomotion of mice in the open field after gavage (a) and determination results of ethanol and acetaldehyde contents in serum (b)

3 結論

本研究在前期建立以精細行為和神經網絡綜合研究為基礎的飲酒后行為與感受層面的飲后舒適度評價模型[24-26]的基礎上，根據廣東米香白酒酒體風味成分的主成分分析，再結合小鼠行為學實驗，以及飲酒后血液乙醇和乙醛代謝及積累程度的分析，對酒樣中在灌胃后舒適度起關鍵作用的酒體風味成分進行初步研究。結果表明，灌胃不同濃度不同風味成分后，在飲酒后行為變化及酒精代謝程度存在差異性，實驗組酒樣與食用酒精對照組相比，醇類物質在灌胃后會引起小鼠行為參數下降整體表現為行為抑制狀態，其中異丁醇和異戊醇抑制作用顯著（P＜0.05），而血清中乙醛的積累量也高于食用酒精對照組，醛類物質中僅乙醛對小鼠行為抑制作用顯著（P＜0.05），且血清中乙醛積累量顯著高于對照組（P＜0.05），有機酸類物質和酯類物質雖對小鼠行為有抑制作用，但差異不顯著（P＞0.05）。本實驗結果為廣東米香白酒及其他白酒高提高飲后代謝以及產品品質提高提供研究支持。