基于非靶向代謝組學分析老面酵頭傳代發酵過程中的代謝差異

楊小萍，卜曉苑，吳 慶，辛世華，賀曉光

（1.寧夏工商職業技術學院 旅游管理系，寧夏 銀川 750021；2.寧夏大學 食品與葡萄酒學院，寧夏 銀川 750021）

老面酵頭，又稱酸面團，是我國家庭自用和小作坊生產制作發酵面制品如饅頭、包子的一種傳統發酵劑，由谷物與水混合經微生物發酵后的一類多菌群組成的混菌發酵體系，其中優勢菌群為酵母菌和乳酸菌[1]。老面酵頭發酵主要采用傳統自然發酵，其中的微生物來自于自然環境，在室溫（20～30 ℃）長時間反復發酵，每次使用后留一部分（即發酵劑）重新接種至原料中用于下一次的發酵，這樣的過程也稱之為傳代處理[2]。目前，我國發酵面制品的工業化生產主要采用活性干酵母粉發酵，具有快速、便捷和穩定等特點[3]。然而長期以來，以北方地區為代表的主食饅頭，仍多沿用傳統老面酵頭發酵技術的作坊式加工方式，其主要原因在于老面酵頭賦予饅頭獨特的質地和濃郁的風味，始終受到消費者們的青睞[4]。

風味物質主要由揮發性香氣物質和非揮發性滋味物質構成[3]。目前，已有許多的研究運用代謝組學技術對食品、發酵制品及發酵過程中的風味物質進行定性定量分析[5-9]。關于酸面團饅頭及面包等已成型面制品揮發性風味物質的研究也有較多報道[2，10]，但關于發酵面食品中非揮發滋味物質的研究相對較少[2，11]，尤其是對不同傳代次數下非揮發滋味物質的變化及特征風味物質代謝形成機制研究更少。

基于此，本研究以老面酵頭為研究對象，采用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜（ultra performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UHPLC-QTOF-MS）非靶向代謝組學技術探討老面酵頭傳代過程中（1代、2代和4代）風味物質的變化，通過主成分分析（principal component analysis，PCA）與正交偏最小二乘-判別分析（orthogonalpartialleastsquares-discriminantanalysis，OPLS-DA）等模式篩選差異代謝物，并分析相關的代謝通路，為老面酵頭發酵生產中風味控制技術提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

老面酵頭：實驗室保存；中筋小麥粉：寧夏塞北雪面粉有限公司；甲醇、乙腈、氨水、水（均為色譜純）：美國Fisher公司；醋酸銨（分析純）：德國Sigma公司；2-氯苯丙氨酸（分析純）：吉爾生化有限責任公司。其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

Acquity超高效液相色譜儀、ACQUITY UPLC BEH Amide色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）：美國Waters公司；QExactive高分辨質譜儀：美國ThermoFisherScientific公司；TGL-16K離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；JA 1003電子天平：上海力辰儀器科技有限公司；SCIENTZ-48研磨儀：上海凈信科技有限公司；Integral 15純水儀：德國Merck Millipore公司；SB25-12D超聲儀：寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

稱取50.0 g實驗室保存的老面酵頭，加入105 mL蒸餾水室溫下浸泡10 min，然后加入200 g小麥面粉，攪拌均勻；在溫度為28～30 ℃、相對濕度為70%～75%的條件下發酵16 h，取樣品，部分保存至-80 ℃冰箱；剩余部分重復上述操作，繼續做傳代處理，共傳代4次，取第1代、第2代、第4代老面酵頭，分別命名為G1、G2和G4。

1.3.2 樣品預處理

將G1、G2和G4樣品從-80 ℃冰箱中取出并在冰上解凍，取樣品100 mg至2 mL EP管中，加入400 μL提取液（甲醇∶乙腈=1∶1，V/V）；渦旋振蕩30 s，充分混勻，超聲10 min，-20℃靜置1h；將樣本在4 ℃、13 000 r/min條件下離心15 min；取350 μL上清液于1.5 mL EP管中，在真空濃縮器中干燥提取物；向干燥后的代謝物加入150 μL提取液（乙腈∶水=1∶1，V/V）復溶，渦旋30 s，冰水浴超聲10 min；將樣本在4 ℃、13 000 r/min條件下離心15 min，取50 μL上清液于2 mL進樣瓶進行檢測分析。

1.3.3 UHPLC-QTOF-MS分析[12-13]

液相色譜條件：Waters ACQUITY UPLC BEH Amide色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相為A相（0.1%甲酸-水溶液）和B相（乙腈）；洗脫程序為95%A，0～1 min；5%A，1～13.5 min；95%A，13.5～16 min。

質譜條件：采用正負離子掃描模式。加熱器溫度300 ℃；鞘氣流速45 arb；輔助氣流速15 arb；尾氣流速1 arb；電噴霧電壓3.0 kv（正）和3.2 kv（負）；毛細管溫度350 ℃；S-Lens RF Level為30%（正）和60%（負）；掃描模式為一級全掃描（70～1 050 m/z）與數據依賴性二級質譜掃描（dd-MS2，TopN=10）；分辨率70 000（一級質譜）和17 500（二級質譜）；碰撞模式為高能量碰撞解離。

1.3.4 數據處理與分析

將所得數據輸入SIMCA軟件包（version 14.0），利用主成分分析（PCA）、正交偏最小二乘-判別分析（OPLS-DA）進行模式識別分析，篩選差異代謝物，作為老面酵頭發酵的潛在特征物[14]。根據t檢驗的P值＜0.05，同時OPLS-DA模型第一主成分的變量重要性投影（variable importance in the projection，VIP）＞1，進行差異性代謝物的篩選[15]。通過差異代謝物對京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）、PubChem等權威代謝物數據庫進行映射，找到所有差異代謝物參與的通路；然后對差異代謝物所在通路綜合分析，根據代謝通路富集分析的P值和通路綜合重要性得分的Impact值，篩選出顯著關鍵代謝通路，進行差異代謝物富集分析[16]。

2 結果與分析

2.1 多元變量分析

采用UHPLC-QTOF-MS分別對老面酵頭樣品G1、G2及G4的代謝物進行檢測分析，并對檢測數據進行PCA，PCA得分圖見圖1。

圖1 基于UHPLC-QTOF-MS分析結果不同老面酵頭樣品的主成分分析得分圖Fig.1 Principal component analysis score plot of different sourdough samples based on UHPLC-QTOF-MS analysis results

由圖1可知，樣品在95%置信區間且組間分離程度良好，表明不同傳代次數對老面酵頭發酵過程有影響。

為驗證模型的準確性，對UHPLC-QTOF-MS檢測數據進行進一步OPLS-DA分析，OPLS-DA得分圖見圖2。由圖2可知，老面酵頭樣品G1和G2、G2和G4均完全區分；但各組內樣品呈現一定發散分布，說明老面酵頭傳代發酵過程中存在明顯差異。G1和G2組與G2和G4組模型的可解釋變量RX2分別為0.967和0.989，模型的可預測度Q2分別為0.962和0.966，說明該模型能很好地解釋和預測兩組樣本之間的差異。

圖2 基于UHPLC-QTOF-MS分析結果不同老面酵頭樣品的正交偏最小二乘－判別分析得分圖Fig.2 Orthogonal partial least squares-discriminant analysis score plot of different sourdough samples based on UHPLC-QTOF-MS analysis results

采用置換檢驗通過隨機多次改變分類變量Y的排列順序次數（n=200）以獲取隨機模型的R2和Q2值進而驗證模型的有效性[17]，結果見圖3。

由圖3可知，G1和G2組與G2和G4組的截距值R2分別為0.911和0.910，Q2分別為0.013和-0.232，表明建立的模型能夠反映樣本實際情況，說明基于UHPLC-QTOF-MS檢測數據建立的OPLS-DA模型用于不同傳代次數老面酵頭間的區分是可信的。

圖3 基于UHPLC-QTOF-MS分析結果不同老面酵頭樣品的響應排序檢驗圖Fig.3 Response ranking test chart of different sourdough samples based on UHPLC-QTOF-MS analysis results

2.2 差異代謝物的篩選和鑒定

基于OPLS-DA模型，以同時滿足OPLS-DA模型第一主成分的VIP值＞1.0，t檢驗的P值＜0.05為標準，篩選不同傳代次數老面酵頭樣品間的差異代謝產物，計算代謝物在兩組間表達量的差異倍數（fold change，FC）值，結果見表1。

表1 不同老面酵頭樣品間的差異代謝物Table 1 Differential metabolites among different sourdough samples

續表

由表1可知，共篩選出7大類54種差異代謝物，差異代謝物的種類由多到少依次為氨基酸及肽類、糖類、酯類、有機酸類、其他類、胺類和醇類。

由表1可知，老面酵頭樣品G1和G2間的差異代謝產物數量明顯多于樣品G2和G4，可能是老面酵頭傳代過程中代謝產物種類更趨于穩定。對于差異代謝物的含量，樣品G1和G2間的差異代謝物麥芽五糖、D-麥芽糖、α-D-葡萄糖、麥芽三糖、纖維二糖、D-阿洛糖、絲氨酸-賴氨酸-賴氨酸、絲氨酸-絲氨酸-精氨酸、絲氨酸-絲氨酸-精氨酸、1-硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿、三乙醇胺、鞘氨醇和和香蘭素的相對含量均隨傳代次數的增加呈上升趨勢（FC值＞1），尤其是絲氨酸-賴氨酸-賴氨酸、絲氨酸-絲氨酸-精氨酸、1-硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿、三乙醇胺、香蘭素（FC值＞2），其余差異代謝物的相對含量呈下降趨勢（FC值＜1），而樣品G2和G4間的差異代謝物的相對含量均呈下降趨勢（FC值＜1）。

酸化是老面酵頭發酵的重要特征，適量的有機酸能夠提升發酵米面制品的整體風味[18]。除有機酸外，在面團發酵過程中，微生物的蛋白水解作用以及面粉中的蛋白酶能夠將面粉中的蛋白質分解為氨基酸，氨基酸的產生也是影響產品風味的重要因素[4，19]。本研究也證實了這一點，樣品G1和G2與樣品G2和G4間的差異代謝物主要為氨基酸及肽類，但是其相對含量較低。有研究表明是老面酵頭中的微生物如乳酸菌和酵母菌大量消耗氨基酸以供生長需要，進而導致面團中氨基酸的含量降低[20]。老面酵頭發酵過程中，麥芽糖是一類含量較高的糖類，主要是因為面粉中含有豐富的淀粉酶，能夠將淀粉水解為麥芽糖。由表1亦可知，糖類的相對含量呈現先增加后減少的趨勢，這可能是因為在發酵過程中，面粉中的淀粉在其內在α-淀粉酶的作用下被分解為麥芽糖和葡萄糖，從而使麥芽糖和葡萄糖的含量增加[21]；但是老面酵頭中的糖酵解途徑會利用和消耗面團中的葡萄糖、麥芽糖、果糖、蔗糖等糖類產生CO2和乙醇，保持面包及饅頭疏松多孔的結構，使面團中麥芽糖、葡萄糖等糖類含量均有所減少[4，22]。對于酯類，脂肪水解生成的游離脂肪酸是發酵食品中特定香氣的主要來源，脂肪酸經過分解代謝生成的仲醇、甲基酮、酯類和等揮發性香氣物質，是饅頭和面包等發酵面食品中的重要香氣組成成分[23]。

2.3 差異代謝物的聚類分析

為了直觀觀察老面酵頭傳代發酵過程中差異代謝物相對含量的變化，依據每個差異代謝物的相對含量繪制熱圖，結果見圖4。由圖4可知，老面酵頭樣品G1和G2的差異代謝物數量明顯多于樣品G4，并且主要的差異代謝物集中在氨基酸及肽類，其次為有機酸類、糖類、胺類、醇類和其他類。閆博文[3]研究發現，傳統老面酵頭發酵制得饅頭樣品中的特征性差異滋味物質主要為氨基酸、有機酸、糖和醇類化合物，它們是賦予饅頭麥香、果香和甜香等滋味的重要來源，與本研究結果一致。樣品G1中氨基酸及肽類數量明顯多于樣品G2和G4，樣品G2的糖類數量明顯多于樣品G1，說明在傳代到第2代時產生了更多的糖類、尤其是麥芽糖。丙氨酸-亮氨酸-精氨酸、絲氨酸-絲氨酸-精氨酸、絲氨酸-賴氨酸-賴氨酸在樣品G2和G4中相對含量比較高。有研究表明，酸面團發酵過程中，酵母菌的自身代謝需要消耗大量游離氨基酸，同時體系環境的限制使蛋白酶對谷物蛋白的降解作用減弱，進而導致面團體系中游離氨基酸及多肽的含量相對較低[23]，這可能是造成氨基酸及肽類在傳代過程中相對含量逐漸降低的主要原因。

圖4 不同老面酵頭樣品間的差異代謝物的層次聚類分析熱圖Fig.4 Hierarchical clustering analysis heat map of differential metabolites among different sourdough samples

2.4 差異代謝物的代謝通路分析

老面酵頭的發酵過程受到多種因素的共同調控，并不能僅僅根據某一物質的含量變化進行整體判斷，需進一步對其代謝通路進行分析，找到發酵過程中潛在的代謝途徑。因此，對老面酵頭傳代發酵過程中差異代謝物的代謝途徑進行分析，結果見表2。由表2可知，參與老面酵頭發酵過程的關鍵代謝通路有15條，分別為細胞凋亡、壞死性凋亡、鞘脂信號通路、鞘脂代謝、近端小管碳酸氫鹽回收、碳水化合物消化吸收、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、味覺轉導、淀粉和蔗糖代謝、磷酸轉移酶系統（phosphotransferase system，PTS）、三磷酸腺苷-結合盒（adenosine triphosphate-binding cassette，ABC）轉運蛋白、膽堿代謝途徑、胰島素抵抗、乙醚脂質代謝、甘油磷脂代謝的相關代謝途徑。

表2 老面酵頭傳代發酵過程中差異代謝物的代謝通路分析結果Table 2 Metabolic pathway analysis results of differential metabolites of sourdough during generation fermentation

由表2亦可知，15條關鍵代謝途徑中主要參與的差異代謝物有14個，分別為鞘氨醇、鞘磷脂、L-谷氨酸、α-D-葡萄糖、麥芽三糖、D-麥芽糖、N-乙酰-L-天冬氨酸、纖維二糖、N-乙酰-D-氨基葡萄糖、D-阿洛糖、3-磷酸甘油、1-（9Z-十八烯?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿、甘油磷酸膽堿、乙酰肉堿。其中D-麥芽糖（5條）、L-谷氨酸（4條）、鞘氨醇（4條）、鞘磷脂（3條）、纖維二糖（3條）、甘油磷酸膽堿（3條）均參與了3條以上的代謝途徑，而同一代謝物若同時參與了多條代謝通路，說明該差異代謝物對通路具有較大的影響，可視為關鍵代謝產物。

D-麥芽糖、纖維二糖、麥芽三糖、N-乙酰-D-氨基葡萄糖、D-阿洛糖、3-磷酸甘油均參與腺苷三磷酸結合盒（adenosine triphosphate-binding cassette，ABC）轉運蛋白。ABC轉運蛋白是一類跨膜蛋白，能夠利用腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）水解產生的能量將底物如糖類、氨基酸、有機酸、多肽、蛋白質等無機物和有機物進行跨膜運輸，進而參與營養攝入、脂質穩態、信號轉導等重要的生理過程[24]。氨基酸、有機酸、糖類的代謝與合成增強對產品風味有重要影響。老面酵頭在發酵過程中，酵母菌和乳酸菌均能夠利用面團中的葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖等可發酵糖類進行糖類代謝。在麥芽糖磷酸化酶的作用下，麥芽糖優先被水解生成葡萄糖和葡萄糖-1-磷酸，葡萄糖-1-磷酸則進一步代謝生成乙酸、乳酸、乙醇、甘油等風味化合物，同時部分的可發酵糖類會轉化成乙醇和二氧化碳使制品疏松多孔外，還能夠將剩余的糖分解成酯類、醇和脂肪酸等風味化合物[19，25]。L-谷氨酸、N-乙酰-L-天冬氨酸主要參與丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝。楊浣漪[4]對釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）與舊金山乳桿菌（Lactobacillus sanfranciscensis）混合發酵引起的釀酒酵母表達明顯變化的基因進行基因本體論（gene ontology，GO）和京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析發現，釀酒酵母的氨基酸（甘氨酸、蘇氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、脯氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸等）代謝與合成過程都有顯著的差異，并且這些過程的改變對饅頭的品質均會有一定的影響，這與本研究的谷氨酸、天冬氨酸和丙氨酸代謝是關鍵代謝產物的研究結果一致。1-（9Z-十八烯酰基）-sn-甘油-3-磷酸膽堿、甘油磷酸膽堿參與膽堿代謝、甘油磷脂代謝；甘油磷酸膽堿還參與乙醚脂質代謝。脂質的代謝對細胞、組織等生理功能的調控具有重要影響，如肥胖、腫瘤、冠心病、糖尿病等病癥的產生主要是異常的脂質代謝存在于病理性紊亂中[26]；并且食品加工中的脂質變化如脂質水解、脂質氧化、脂質聚合及美拉德反應等均對食品質量有一定的影響[27]。磷酸膽堿可作為食品添加劑如潤濕劑、乳化劑、釀造制品的品質改良劑等應用于乳制品、點心、餅干、蛋糕等制品中，進而提高制品的軟綿性和酥松性[28]。鞘氨醇、鞘磷脂參與壞死性凋亡、鞘脂信號通路、鞘脂代謝途徑。鞘磷脂由鞘氨醇、脂肪酸、磷酸與含氮堿基組成。在質膜上，鞘脂可以轉化為鞘氨醇，再被鞘氨醇激酶催化生成鞘氨醇1-磷酸，而鞘氨醇1-磷酸也屬于溶血磷脂，是重要的生物活性介質，參與多種信號轉導途徑，調節多種不同的細胞功能[29]。

3 結論

本研究采用UHPLC-QTOF-MS的非靶向代謝組學技術研究方法，通過KEGG數據庫注釋差異代謝物，從老面酵頭傳代發酵過程中共檢測到54種非揮發性差異代謝物，主要的差異代謝物種類為氨基酸及肽類、有機酸類、糖類，隨著傳代次數的增加，差異代謝產物數量明顯減少，代謝產物種類和數量更趨于穩定。氨基酸及肽類和有機酸類總體呈下降趨勢，而糖類總體呈先上升后下降趨勢。通過差異代謝物的聚類分析，老面酵頭發酵1代和2代的差異代謝物數量明顯多于4代。根據代謝通路富集分析的P值和通路綜合重要性得分的Impact值，篩選出15條與代謝物差異相關性較高的關鍵通路和14種主要參與的差異代謝物。其中，D-麥芽糖、纖維二糖、L-谷氨酸、鞘氨醇、鞘磷脂、甘油磷酸膽堿均參與了3條以上的代謝途徑，被視為關鍵代謝產物。本研究結果可為老面酵頭發酵過程中風味控制技術提供一定的理論參考。