乳酸菌固態發酵豆粕產酸性能分析

侯楠楠，王 梅，王 倩，陳 靜，谷 巍，謝全喜

（山東寶來利來生物工程股份有限公司 山東省動物微生態制劑重點實驗室，山東 泰安 271000）

生物發酵飼料是利用微生物、復合酶為生物飼料發酵劑菌種，將飼料原料轉化成微生物菌體蛋白、生物活性小肽類氨基酸、微生物活性益生菌、復合酶制劑為一體的生物發酵飼料。隨著“禁抗”、“無抗”養殖模式的推進，發酵飼料越來越受到大眾的關注。乳酸菌是指能夠發酵糖類主要產物為乳酸的一類無芽孢、革蘭氏染色為陽性的細菌的總稱。目前，乳酸菌作為最重要的飼用益生菌之一，其中植物乳桿菌、發酵乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、嗜酸乳桿菌、戊糖片球菌、糞腸球菌等都已被納入飼料添加劑目錄。部分乳酸菌在發酵過程中可以代謝乳糖產生乳酸以及其他有機酸，降低發酵產品pH值[1]。大量的有機酸不僅能夠提高發酵飼料的風味，還直接參與機體的能量、結構代謝以及各種酶促反應。此外有機酸還可以抑制霉菌、大腸桿菌的生長以及毒素的產生；具有降低胃腸道的pH值，促進胃腸排空以及營養物質的吸收的作用[2]。

研究表明乳酸菌作為益生菌具有多種生理功能。在食品上應用可以改善食品風味延長保質期，在飼料中添加可以改善飼料品質，提高飼料抗菌性能。王雪洋等[3]研究發現，使用乳酸菌發酵豆渣可提高其乳酸含量及有氧穩定性。甜高粱青貯料中添加短乳桿菌、植物乳桿菌可以促進乳酸菌的增殖，降低青貯pH值，提高青貯飼料品質[4]。乳酸菌產生的有機酸主要包括乳酸、乙酸、草酸、檸檬酸、酒石酸等。乳酸是動物機體自身代謝產物，用于飼料中可直接參與機體新陳代謝，是三羧酸循環的燃料，同時還能夠維持腸道菌群平衡，降低腹瀉，促進鈣磷的吸收[5]。乙酸可以促進腸粘膜緊密連接蛋白等相關蛋白的表達，降低腸道通透性，促進腸粘膜細胞增殖[6]，也是一種很好的抑菌劑、酸味劑、酸度調節劑。酒石酸多存在于植物果實和葉子中，在葡萄酒的釀造中會產生大量酒石酸，具有抗氧化作用[7]。檸檬酸是飼料常用防腐劑，具有防霉抗氧化作用，還可以改善飼料風味、增加酸度、清除有害金屬[8]。蘋果酸是一款優良的穩定劑，具有較強的殺菌效果以及抗氧化作用，同時還能促進氨基酸的吸收。與檸檬酸相比具有高酸度、低熱量、味道柔和的特點[9-10]。據報道，乳酸菌抑菌、促消化等功效與其產酸能力有極大相關性，因此對乳酸菌產酸能力的分析顯得尤為重要。

本研究以6株乳酸菌為研究對象，對其發酵液及固態發酵豆粕產酸性能進行分析，揭示其在提高發酵飼料品質風味的潛在應用，為乳酸菌發酵飼料提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentium）BLCC2-0021、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）BLCC2-0204、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）BLCC2-0026、0327、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）BLCC2-0069、0410：寶來利來生物工程股份有限公司菌種保藏中心。

1.1.2 材料

國產大豆粕（初始水分10.25%），黃色、無霉變、無結塊和異味，粉碎后過篩。

1.1.3 化學試劑

乙醇、甲醇（均為色譜純）：天津市永大化學試劑有限公司；磷酸二氫銨、磷酸（均為分析純）：天津市凱通化學試劑有限公司；草酸、蘋果酸、酒石酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸（均為色譜純）：上海源葉生物有限公司。

1.1.4 培養基

MRS液體培養基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉膏8 g/L，酵母膏4 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，硫酸錳0.3 g/L，檸檬酸銨2 g/L，乙酸鈉5 g/L，吐溫-80 1 mL/L，pH值6.0，121 ℃滅菌20 min。固體培養基額外添加瓊脂粉15 g/L。

1.2 儀器與設備

LC-20A高效液相色譜（high performance liquid chro matography，HPLC）儀、InertSustain AQ-C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）色譜柱：日本島津公司；AL204電子分析天平：瑞士梅特勒托利多有限公司；GL21M高速冷凍離心機：湖南凱達科學儀器有限公司；CLDC271509超純水凈化系統（超純水儀）：重慶潺林熱能設備有限公司；PHS-3C雷磁精密酸堿度計：上海精密科學儀器有限公司；SB120D超聲波清洗機：寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 有機酸標準曲線的建立

分別準確稱取50 mg的草酸、蘋果酸、酒石酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸標準品，使用超純水定容至50 mL，作為有機酸混合標準品工作液。經0.22 μm微孔濾膜過濾后，用流動相將混合標準品工作液逐級稀釋得到質量濃度為0.5g/L、1.0 g/L、2.5 g/L、5.0 g/L、10.0 g/L的混合標準工作液，進行高效液相色譜檢測。HPLC法測定有機酸條件：色譜柱InertSustain AQ-C18（5μm，4.6mm×250 mm），柱溫箱28 ℃，進樣量20μL，流速0.8 mL/min，流動相20 mmol/L磷酸鹽溶液（pH值2.3），檢測波長210 nm。

1.3.2 乳酸菌液態發酵[5]

將6株乳酸菌凍干粉分別接種于MRS固體斜面培養基上，37 ℃培養48 h。將培養好的斜面無菌接種至MRS液體培養基，100 mL鹽水瓶裝液量為95 mL，37 ℃培養24 h。取樣檢測乳酸菌活菌數、pH、總酸、有機酸。

1.3.3 乳酸菌固態發酵豆粕[5]

取6株乳酸菌凍干粉分別接種于MRS固體斜面培養基上，37 ℃培養48 h。將培養好的斜面無菌接種至MRS液體培養基，37 ℃培養24 h。按照2%的接種量分別發酵豆粕，1∶0.45（g∶mL）的料水比，裝料量250 g/袋，壓實。以不接種任何菌株的空白料為對照組，37 ℃發酵72 h。以上發酵試驗均是生料發酵。取樣檢測發酵豆粕的pH、總酸、有機酸等。

1.3.4 理化指標和微生物指標的檢測

pH檢測：取混合均勻的發酵液10 mL直接采用玻璃電極pHS-3C型pH計測定。豆粕的檢測則稱取10.00 g，加90 mL蒸餾水，混合均勻后靜置10 min后測定。

總酸：取混合均勻的發酵液10 mL（豆粕10.00 g），參照GB/T 12456—2021《食品安全國家標準食品中總酸的測定》進行測定。

酸溶蛋白：采用三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）法測定。

粗蛋白的含量（以干物質計）：按GB/T 6432—2018《飼料中粗蛋白的測定凱氏定氮法》測定。

粗灰分的含量（以干物質計）：按照GB/T 6438—2007《飼料中粗灰分的測定》測定。

乳酸菌活菌數的檢測：準確量取發酵液10 mL（發酵豆粕10.00 g）加入至90 mL無菌生理鹽水中，參照GB 4789.35—2016《食品微生物學檢驗乳酸菌》檢測乳酸菌活菌數。

1.3.5 有機酸檢測

（1）發酵液有機酸檢測：取混合均勻的發酵液1.5 mL，10 000 r/min離心5 min取上清，經0.22 μm濾膜兩次過濾后作為待測樣品。按照1.3.1中的色譜條件進行有機酸檢測。

（2）固態發酵豆粕有機酸檢測：準確稱取3.000 g發酵料樣品加入體積分數85%乙醇10 mL，將樣品混合均勻后75 ℃水浴30 min，混勻后經4 000 r/min離心5 min，取上清至25 mL刻度試管，再加體積分數85%乙醇7 mL，混勻后經4 000 r/min離心5 min，再取上清至25 mL刻度試管，定容。取定容好的溶液10 mL至坩堝，蒸干，加2 mL超純水溶解，回收液體，10 000 r/min，離心5 min取上清，經0.22 μm濾膜兩次過濾后作為待測樣品。按照1.3.1中色譜條件進行有機酸檢測。

1.3.6 數據分析

試驗數據用Excel 2019軟件進行初步處理后，采用SPSS 13.0進行統計分析，采用One-way ANOVA進行方差分析，最小顯著差異（leastsignificantdifference，LSD）法進行組間多重比較，結果以“平均值±標準差”表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 有機酸含量的測定

草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸7種有機酸的混標色譜圖見圖1。結果表明，7種有機酸分離效果較好，無拖尾現象。將混合標曲按照從低到高的順序進樣，以目標峰峰面積（Y）和對應有機酸質量濃度（X）進行線性分析，得到各有機酸標準曲線線性回歸方程，結果見表1。由表1可知，7種目標峰峰面積與濃度線性關系良好，相關系數均＞0.99，可用于后續發酵制品中有機酸的檢測。

圖1 7種有機酸混標HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of 7 kinds of organic acids mixed standards

表1 7種有機酸線性方程及相關系數Table 1 Linear equations and correlation coefficients of 7 kinds of organic acids

2.2 不同乳酸菌活菌數及產酸性能分析

2.2.1 乳酸菌發酵液活菌數、pH及總酸含量

6株乳酸菌液體發酵24 h 后發酵液的乳酸菌數、pH值及總酸含量測定結果見表2。結果表明，6株菌經MRS培養基培養后活菌數均能達到108CFU/mL。菌株BLCC2-0069、BLCC2-0410活菌數量顯著高于其余4株菌（P＜0.05），表明植物乳桿菌生長更迅速，戊糖片球菌菌株BLCC2-0026、BLCC2-0327生長較緩慢。檢測6株菌發酵液的pH值及總酸含量發現，不同菌株產酸性能不同，菌株BLCC2-0069、BLCC2-0410總酸含量顯著高于其余4種菌（P＜0.05），pH值結果相類似，表明與發酵乳桿菌、嗜酸乳桿菌、戊糖片球菌相比，植物乳桿菌具有高的產酸性能。

表2 乳酸菌發酵液乳酸菌活菌數、pH值、總酸含量測定結果Table 2 Determination results of the number of viable lactic acid bacteria,pH and total acid content of lactic acid bacteria fermentation broth

2.2.2 乳酸菌發酵液有機酸含量分析

隨后進一步對6株乳酸菌發酵液中有機酸進行分析，結果見表3。

由表3可知，不同菌株有機酸組成存在差異，發酵乳桿菌BLCC2-0021發酵液中乙酸產量為11.63 g/L，顯著高于其余各菌株（P＜0.05）。發酵乳桿菌屬于異型乳酸菌，異型乳酸菌發酵可以產生乳酸、乙酸、CO2等，李鳳姿等[11]也有相同發現，使用發酵乳桿菌、短乳桿菌發酵酸菜與同型乳酸菌發酵組相比乙酸含量明顯提高。嗜酸乳桿菌BLCC2-0204發酵液蘋果酸含量顯著高于其余各菌株（P＜0.05）；乳酸菌BLCC2-0327發酵液檸檬酸產量高達2.55 g/L，顯著高于其余各菌株（P＜0.05），乳酸菌BLCC2-0026與BLCC2-0327產生的有機酸以乳酸為主，乳酸占總有機酸比例最高可達60%。

表3 乳酸菌發酵液有機酸含量測定結果Table 3 Determination results of organic acid content in lactic acid bacteria fermentation broth g/L

植物乳桿菌BLCC2-0410與BLCC2-0069發酵液中草酸、酒石酸、乳酸、琥珀酸產量均顯著高于其余各菌株（P＜0.05）。與董玲等[12]篩選到高產乳酸的乳桿菌使用MRS肉湯培養基發酵48 h乳酸含量可達17.45 g/L研究結果相似。植物乳桿菌產生大量乳酸可能與其能夠合成大量β-半乳糖苷酶有關，乳糖通過乳酸菌產生的β-半乳糖苷酶分解成葡萄糖和半乳糖，半乳糖進一步代謝產生乳酸，其中前者為限速步驟[13]。酒石酸可以增加發酵料風味，本試驗中不同乳酸菌發酵液酒石酸產量差異較大，植物乳桿菌產量顯著高于其它菌株，可能是與菌株特性有關[14]。琥珀酸可以增加食品的鮮味[15]，但經乳酸菌發酵后MRS培養基中的琥珀酸含量均顯著降低，可能是培養基中的琥珀酸被乳酸菌利用[16]。

2.3 不同乳酸菌固態發酵豆粕性能分析

2.3.1 乳酸菌發酵豆粕產酸及理化指標分析

使用不同乳酸菌固態發酵豆粕，其乳酸菌數、pH值以及總酸含量等測定結果見表4。由表4可知，發酵豆粕72 h后乳酸菌活菌數均能達到109CFU/g，顯著高于空白未發酵組（P＜0.05），表明乳酸菌可以很好地利用豆粕進行發酵；與發酵液活菌數結果相似，菌株BLCC2-0069、BLCC2-0410固體發酵豆粕活菌數量顯著高于其余4株菌（P＜0.05）。與未發酵組相比經乳酸菌發酵的豆粕pH值均顯著降低（P＜0.05），其中植物乳桿菌BLCC2-0410組下降幅度最大，下降33.89%。在產酸效果上，經乳酸菌發酵后的豆粕總酸含量均顯著高于未發酵組（P＜0.05），植物乳桿菌BLCC2-0410組產酸量最高，顯著高于其他組（P＜0.05）。此外，與未發酵組相比，乳酸菌發酵可以顯著提高豆粕酸溶蛋白的含量（P＜0.05），與乳酸菌代謝產生蛋白酶，降解大分子蛋白形成小肽有很大關系，但各種菌之間差異不大；發酵與否對豆粕粗蛋白、粗灰分影響不大（P＞0.05）。

表4 不同菌株發酵豆粕乳酸菌活菌數、pH及營養成分測定結果Table 4 Determination results of the number of viable bacteria,pH and nutritional compositions of fermented soybean meal with different strains

本研究發現經過乳酸菌發酵后的豆粕，富含豐富益生菌，有利于動物腸道健康；酸溶蛋白含量顯著提高，更有利于豆粕的消化吸收。豆粕pH降低、豆粕總酸含量提高，增加了豆粕的適口性，李杰等[17-18]的研究也是相似結果。但各菌株之間發酵豆粕差異不是非常顯著，隨后又對發酵豆粕的有機酸組成進行了分析。

2.3.2 不同乳酸菌固態發酵豆粕產有機酸分析

發酵豆粕的核心是降解大分子的蛋白、消除抗營養因子等[19-21]，但豆粕發酵提高有機酸的產量，增加飼料風味，同樣受到廣大研究者的關注[22-23]。不同乳酸菌發酵豆粕產有機酸的含量見表5。

由表5可知，不同乳酸菌固態發酵豆粕，其有機酸總含量均顯著高于未發酵組（P＜0.05），不同有機酸含量又各不相同。其中乳酸、乙酸比較一致，經乳酸菌發酵后豆粕中乳酸、乙酸的含量均顯著高于未發酵組（P＜0.05）。相反，草酸、酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸，發酵與否變化不一致，可能與豆粕本身會含有一定量草酸、酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸有關。乳酸菌在產生這些酸的同時，也會利用一部分，這與毛銀等[24]的研究結果相似。

表5 不同菌株發酵豆粕有機酸含量測定結果Table 5 Determination results of organic acid content in soybean meal fermented by different strain g/kg

不同菌株固態發酵豆粕產生有機酸也存在差異。乳酸菌BLCC2-0021、BLCC2-0410產酸效果最佳，有機酸總含量分別可達61.28 g/kg、61.37 g/kg，與其他菌株相比差異顯著（P＜0.05）；其次是乳酸菌BLCC2-0069，但與發酵液的產量結果稍有差異。乙酸、乳酸、酒石酸是發酵豆粕主要的三種有機酸，與發酵液中有機酸組成相似。植物乳桿菌BLCC2-0410固態發酵豆粕乳酸產量是18.91 g/kg，顯著高于其他菌株發酵組（P＜0.05），乳酸菌利用還原糖代謝產生大量乳酸，形成發酵豆粕主要風味。植物乳桿菌BLCC2-0410固體發酵豆粕還可以產生大量酒石酸、檸檬酸，產量分別為10.43 g/kg、3.79 g/kg；草酸、蘋果酸、乙酸、琥珀酸含量優勢不大，這與乳酸菌液態發酵結果也是相似的。以菌株BLCC2-0410為例的植物乳桿菌屬于同型乳酸菌，同型菌發酵僅通過糖酵解途徑產生乳酸；異型菌可以糖酵解途徑產生乳酸，還可以磷酸戊糖酮解酶途徑和磷酸己糖酮解酶途徑產生乙醇和二氧化碳[25-27]。

本試驗還發現，發酵豆粕乙酸的產量與乳酸菌的類型有關。菌株BLCC2-0021是發酵乳桿菌屬于異型乳酸菌，固態發酵豆粕乙酸產量為35.05 g/kg，顯著高于其他菌株發酵組（P＜0.05）。微生物利用糖或淀粉等原料可以產生乙醇，進一步氧化可以產生大量乙酸，單純的乙酸刺激性味道比較大，而發酵豆粕的芳香味道與其含大量乳酸、酒石酸等有關。李鳳姿等[11]也有類似發現，使用不同乳酸桿菌對酸菜進行發酵，短乳桿菌和發酵乳桿菌接種處理的酸菜乙酸質量濃度最高；彎曲乳桿菌和植物乳桿菌接種處理酸菜發酵乳酸質量濃度最高。此外，菌株BLCC2-0021固體發酵豆粕草酸含量也顯著高于其他菌株，但研究表明，草酸會降低鈣、鋅等礦物質元素的生物利用率，在體內與鈣離子結合形成草酸鈣，導致腎結石[16]。嗜酸乳桿菌BLCC2-0204固體發酵豆粕產酸效果最差，但其蘋果酸、琥珀酸含量顯著高于其他各菌株（P＜0.05）。兩株戊糖片球菌BLCC2-0026、0327產酸性能優勢不顯著。

2.4 討論

研究發現6株乳酸菌產酸能力存在一定差異，相同條件下植物乳桿菌BLCC2-0410活菌數、總酸產量、有機酸含量均明顯優于其他菌株，菌株性能優越產酸性能較好。隨后又對乳酸菌固體發酵豆粕性能進行了研究。研究發現乳酸菌發酵豆粕可以顯著提高豆粕酸溶蛋白、總酸含量，但對豆粕粗蛋白、粗灰分含量影響不大。酸溶蛋白含量的提高有利用豆粕的消化吸收，提高豆粕蛋白消化率。值得關注的是，不同乳酸菌發酵對豆粕酸溶蛋白、粗蛋白、粗灰分的影響差異均不顯著，但在產酸性能上存在差異性。乳酸、酒石酸、蘋果酸等有機酸可以使豆粕更具風味，提高動物采食量。植物乳桿菌BLCC2-0410發酵豆粕產酸性能較好。

3 結論

研究表明，6株乳酸菌液體發酵均能產生乳酸、乙酸等7種有機酸，其中乳酸菌BLCC2-0410、BLCC2-0069、BLCC2-0021產酸效果較好；使用6株乳酸菌發酵后的豆粕有機酸組成因菌株不同存在較大差異，主要含有乳酸、乙酸、酒石酸等。植物乳桿菌BLCC2-0410產酸量最高，同時還能產生大量乳酸、酒石酸、檸檬酸；發酵乳桿菌BLCC2-0021可以提高發酵豆粕乙酸含量，嗜酸乳桿菌BLCC2-0204可以提高發酵豆粕蘋果酸、琥珀酸含量。綜合分析產酸效果較好的是植物乳桿菌BLCC2-0410，發酵液乳酸含量高達19.62 g/L，發酵豆粕乳酸含量可達18.91 g/kg。