自然發(fā)酵咖啡果醋中醋酸菌的分離鑒定

劉 靜，葉朋飛，劉繼華，袁 唯

（1.曲靖職業(yè)技術(shù)學(xué)院 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)系，云南 曲靖 655011；2.曲靖師范學(xué)院 經(jīng)濟與管理學(xué)院，云南 曲靖 655011；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650000）

咖啡（coffee）是咖啡豆經(jīng)過烘焙而成的非酒精性飲料，與茶、可可同為流行于世界的三大飲品，每年咖啡的消耗量僅次于茶，同時也是僅次于石油的第二大貿(mào)易商品[1-4]。我國咖啡主要種植于云南、廣西、海南等地，其中云南是全國咖啡種植面積最大、產(chǎn)量最高的區(qū)域[5-6]。咖啡豆的消耗量越大，產(chǎn)生的咖啡果皮果肉等副產(chǎn)物也越來越多，通常加工1 t小粒咖啡鮮果會產(chǎn)生0.5 t皮渣（包括果皮、果肉），云南小粒咖啡種植區(qū)每年鮮果處理皮渣約39.68萬t[7-8]。雖然國外也有在飼料中加入一定量的咖啡皮渣的報道，但其消化利用率不高，且未實現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)。咖啡果皮果肉容易腐爛變質(zhì)，如果處理不及時就會造成嚴(yán)重的環(huán)境污染，同時還會增加企業(yè)的負(fù)擔(dān)，嚴(yán)重阻礙了企業(yè)的發(fā)展。但咖啡果中含有豐富的生物活性物質(zhì)，如綠原酸[9]、花青素[10]、咖啡酸[11]等多酚類物質(zhì)，這些物質(zhì)具有很好的抗氧化活性[12]、抑菌活性[13]、消炎[14]等功能。同時，咖啡果中還含有天然的咖啡因，咖啡因?qū)ι窠?jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)及偏頭痛等具有一定的積極作用[15-18]。

咖啡果肉中營養(yǎng)物質(zhì)豐富，將其加工成果醋可以很好地保留其中的營養(yǎng)成分，同時提高了資源利用率。目前，尚未有特定的咖啡果醋專用醋酸菌。因此，篩選和開發(fā)適合利用咖啡果發(fā)酵果醋的專用醋酸菌是目前亟需解決的問題。

為挖掘適用于咖啡果醋發(fā)酵的醋酸菌資源，本研究選用自然發(fā)酵的咖啡果醋為原料，采用鈣透明圈初篩、產(chǎn)醋酸定性試驗從中篩選醋酸菌，并通過形態(tài)觀察、生理生化試驗及分子生物學(xué)技術(shù)對其進(jìn)行菌種鑒定。以期用于咖啡果醋的生產(chǎn)釀造工業(yè)中，為該菌株在生產(chǎn)上的應(yīng)用打下理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

自然發(fā)酵的咖啡果醋：購于云南德宏。

1.1.2 培養(yǎng)基[19]液體培養(yǎng)基：葡萄糖1%，酵母粉1%，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min，冷卻到60 ℃，加入3%（V/V）體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇。

選擇培養(yǎng)基：葡萄糖1%，酵母粉1%，瓊脂粉2%，碳酸鈣1%，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min，冷卻到60 ℃，加入3%（V/V）體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇。

半固體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基中添加瓊脂粉0.5%。

乙醇過氧化培養(yǎng)基：酵母膏1 g，0.04%溴酚藍(lán)溶液2 mL、蒸餾水100 mL，pH調(diào)至6.8～7.0之間，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min，冷卻到60 ℃，加入3%（V/V）體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇。

1.1.3 試劑

氫氧化鈉、三氯化鐵、結(jié)晶硫酸銅、酒石酸鉀鈉、無水碳酸鈣、硫酸鎂、硝酸鈉（均為分析純）、革蘭氏染色液：生工生物工程（上海）有限公司；氫氧化鉀（分析純）、氯化鉀（分析純）：西隴化工股份有限公司；一管式通用樣品脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）抽提試劑盒、Taq聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）Master Mix：生工生物工程（上海）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TDL-5-A離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠；XSP-2C顯微鏡：上海中恒儀器有限公司；SW-CJ-1C型雙人單面凈化工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；HWS恒溫培養(yǎng)箱：寧波東南儀器設(shè)備有限公司；YXQ-LS-50S11立式蒸汽滅菌鍋：上海博迅實業(yè)有限公司；T-Gradient PCR儀：德國Biometra公司；DYY-6C恒流恒壓電泳儀：北京市六一儀器廠；BIO-BEST 140E型凝膠圖像分析系統(tǒng)：美國西盟公司。

1.3 方法

1.3.1 富集培養(yǎng)

取10 mL自然發(fā)酵的咖啡果醋于90 mL液體培養(yǎng)基中，30℃、150r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)2d，進(jìn)行醋酸菌的富集培養(yǎng)。

1.3.2 產(chǎn)酸菌株的分離、純化

采用平板涂布及劃線分離法進(jìn)行篩選。取富集培養(yǎng)液1 mL加入9 mL無菌生理鹽水中，振蕩搖勻，按10倍梯度稀釋至10-7。取200 μL稀釋液涂布于選擇培養(yǎng)基中，每個稀釋度做3個平行，30 ℃培養(yǎng)3～5 d，在培養(yǎng)的過程中觀察菌落生長情況，挑取溶鈣圈較大的單菌落進(jìn)行分離純化[20]。

1.3.3 產(chǎn)醋酸定性試驗[21-22]

將初篩得到的菌株接種于液體培養(yǎng)基中，于30 ℃、150 r/min條件下?lián)u床振蕩培養(yǎng)3d，取10mL發(fā)酵液2 500 r/min條件下離心5 min，取上清液，用2.5 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)pH至7.0，加熱至煮沸，然后加入5%FeCl3溶液5～6滴，形成紅褐色沉淀的菌株可以初步鑒定為醋酸菌。

1.3.4 形態(tài)特征觀察

將初步鑒定得到的醋酸菌株接種于半固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)2 d，在培養(yǎng)期間觀察菌株的生長狀況及形成的菌落形態(tài)特征，并進(jìn)行革蘭氏染色，觀察菌株形態(tài)。

1.3.5 生理生化試驗

按照文獻(xiàn)[23-24]方法進(jìn)行生理生化試驗，主要包括接觸酶、氧化酶、乙醇過氧化試驗、明膠液化試驗、生酮試驗等。

1.3.6 產(chǎn)酸能力的測定

將篩選得到的單菌落接種于選擇培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)2 d，測量其溶鈣圈直徑和菌落直徑，計算兩者的比值（H/C值）。

將篩選得到的單菌落接種于液體培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min條件下恒溫?fù)u床培養(yǎng)6 d作為種子液。將種子液按6%（V/V）的接種量接種到液體培養(yǎng)基中，于30 ℃、150 r/min條件下恒溫?fù)u床培養(yǎng)，每隔24 h取樣，采用酸堿滴定法測定產(chǎn)酸量（以醋酸計）[25]。

1.3.7 分子生物學(xué)鑒定

基因組DNA的提取：取150 μL培養(yǎng)24 h的醋酸菌培養(yǎng)液，10000 r/min離心1 min，棄上清液，收集菌體。加入100 μL Qlysis-G Reagent和10 μL Proteinase K，振蕩均勻，65 ℃水浴5 min。95 ℃水浴3 min，加入100 μL Buffer NST，振蕩均勻，12 000 r/min離心5 min，取上清液作為模板直接用于PCR擴增。

PCR擴增條件：以提取的DNA為模板，利用引物799F（5'-AACAGGATTAGATACCCTG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）PCR擴增16S rDNA基因序列。PCR擴增體系（50 μL）：TaqPCR Master Mix（1×）25 μL，DNA模板（10 μg）1 μL，引物799F（10 μmol/L）2 μL；引物1492R（10 μmol/L）2 μL；雙蒸水（ddH2O）補足到50 μL。

PCR擴增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循環(huán)30次；72 ℃再延伸5 min。將PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)0.4%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，采用PCR試劑盒回收，委托生工生物工程（上海）有限公司測序。

系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建：將測序結(jié)果提交至美國國家生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫中，采用基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）檢索同源性，選取同源性較高的模式菌株的16S rDNA基因序列，利用clustal X2.0和Mega 4.0軟件中的鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)而確定其種屬地位。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均平行做3次，采用Origin 8.5制圖，SPSS 18.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)酸菌株的分離及純化

在選擇培養(yǎng)基上挑選出菌落大小一致，溶鈣圈直徑大且生長速度快的單菌落60個，并多次劃線分離純化直至出現(xiàn)獨立分布的單個細(xì)胞，然后培養(yǎng)繁殖成單個菌落，于4 ℃條件下保存，備用。

2.2 產(chǎn)醋酸定性試驗

將60株純化菌株經(jīng)液體培養(yǎng)后進(jìn)行產(chǎn)酸定性試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，部分菌株的發(fā)酵液能夠產(chǎn)生明顯紅褐色沉淀，說明該發(fā)酵液中有醋酸產(chǎn)生；未產(chǎn)生紅褐色沉淀的發(fā)酵液，說明無醋酸產(chǎn)生或該菌株活性太低。最終篩選得到16株產(chǎn)醋酸的菌株，依次編號為A1、A2、A3、…、A16，初步鑒定為醋酸菌。

2.3 形態(tài)觀察

將16株菌株穿刺接種進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)所有的穿刺線的邊緣向周圍霧化，說明菌株均具有運動性。醋酸菌在半固體培養(yǎng)基上的菌落呈現(xiàn)淡黃色，邊緣整齊為圓形，表面隆起光滑，菌落周圍有明顯的碳酸鈣溶解圈，符合醋酸菌的菌落形態(tài)特征。16株菌的革蘭氏染色鏡檢結(jié)果表明，各個菌株的形態(tài)呈現(xiàn)桿狀或短桿狀，單個、成對或成鏈排列，細(xì)胞被染成紅色，為革蘭氏陰性菌。

2.4 生理生化特征試驗

16株菌株的生理生化試驗結(jié)果見表1。由表1可知，菌株A1、A2、A10、A11、A13、A15、A16氧化酶試驗、明膠液化試驗及V-P試驗結(jié)果均為陰性，其他試驗結(jié)果均為陽性；菌株A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、A12、A14的接觸酶試驗、乙醇過氧化試驗及吲哚試驗結(jié)果均為陽性，其他試驗結(jié)果呈陰性。對照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》（第八版）和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》中對醋酸菌生理生化特征的描述，可將16株醋酸菌歸為兩大類，初步鑒定菌株A1、A2、A10、A11、A13、A15、A16為葡糖醋酸桿菌屬（Gluconacetobactersp.），菌株A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、A12、A14為醋酸桿菌屬（Acetobactersp.）。

表1 篩選菌株生理生化試驗結(jié)果Table 1 Results of the physiological and biochemical tests of screened strains

2.5 產(chǎn)酸能力的測定

16株菌的H/C值見表2。由表2可知，篩選出的16株菌的H/C值均＞2.00，其中菌株A4、A7、A9、A10、A14、A15、A16的H/C值均≥3.00，其余菌株的H/C值范圍在2.25～2.89之間。根據(jù)各菌株的H/C值及產(chǎn)醋酸定性試驗中顏色的深淺，選擇菌種A9和A10為目標(biāo)菌株，測定產(chǎn)酸量，結(jié)果見圖1。

表2 篩選菌株的H/C值Table 2 H/C value of screened strain

圖1 菌株A9和A10的產(chǎn)酸量Fig.1 Acid production of strain A9 and A10

由圖1可知，菌株A9、A10的產(chǎn)酸量均隨著發(fā)酵時間的增加而增加，在發(fā)酵0～96 h之間增加的幅度比較大，之后增加緩慢。在整個發(fā)酵過程中，菌株A9的產(chǎn)酸量一直高于菌株A10，最高值達(dá)到3.62 g/100 mL，并且比菌株A10達(dá)到最大值所用的時間要短。因此，確定A9菌株為產(chǎn)酸量高的優(yōu)勢菌株。

2.6 分子生物學(xué)鑒定

菌株A9和A10的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。由圖2可知，菌株A9與羅旺醋桿菌（Acetobacter lovaniensis）聚為一支，親緣關(guān)系最近，菌株A10與木葡糖醋酸桿菌（Gluconacetobacter xylinus）聚為一支，親緣關(guān)系最近。結(jié)合形態(tài)觀察及生理生化試驗結(jié)果，最終鑒定菌株A9為羅旺醋桿菌（Acetobacter lovaniensis），菌株A10確定為木葡糖醋酸桿菌（Gluconacetobacter xylinus）。

圖2 基于16S rDNA基因序列菌株A9和A10的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain A9 and A10 based on 16S rDNA gene sequence

3 結(jié)論

通過富集培養(yǎng)、分離純化，從自然發(fā)酵的咖啡果醋中篩選出60株產(chǎn)溶鈣圈的菌，經(jīng)過產(chǎn)醋酸定性試驗初步篩選出16株醋酸菌。通過菌落形態(tài)觀察、革蘭氏染色試驗及生理生化特征試驗初步鑒定7株為葡糖醋酸桿菌屬（Gluconacetobactersp.），9株為葡糖醋酸桿菌（Gluconacetobactersp.）。通過產(chǎn)酸能力測定，最終篩選得到兩株產(chǎn)酸能力較好的菌株，分別為菌株A9和A10，其中，菌株A9的產(chǎn)酸量高于菌株A10，最高可達(dá)3.62 g/100 mL。結(jié)合形態(tài)觀察、生理生化特征試驗及分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，最終鑒定菌株A9為羅旺醋桿菌（Acetobacter lovaniensis），菌株A10為木葡糖醋酸桿菌（Gluconacetobacter xylinus）。本試驗從咖啡果醋中分離鑒定出了兩株菌，豐富了咖啡果醋加工的醋酸菌來源，由于試驗樣品為自然發(fā)酵的果醋，篩選出的醋酸菌產(chǎn)酸能力有待提高。