發酵營養劑NutrienFast添加時期對葡萄酒發酵的影響

陳 暉，張方方，覃先武，楊 萌，李 輝，常 煦，李志軍，聶文強

（安琪酵母股份有限公司，湖北 宜昌 443200）

在葡萄酒發酵過程中，營養管理是確保發酵順利完成的關鍵，葡萄汁中缺乏含氮物質影響酵母合成生長代謝所需要的蛋白質，特別是酵母可同化氮（yeast assimilable nitrogen，YAN）的缺乏，影響糖類物質運輸和代謝，從而導致發酵產生問題[1-2]。不同年份葡萄汁中的含氮物質之間具有明顯的差異，葡萄汁中的營養物質主要受到葡萄的成熟度、氣候環境、栽培管理技術、土壤條件、施肥等因素的影響[3]。葡萄汁中的含氮營養物質主要包括有機氮和無機氮兩種形式，在不同品種的葡萄、不同的生長年份和不同管理措施的葡萄中有機氮和無機氮之間的比例不同。

在發酵中缺乏營養，酵母生長受到影響，因此出現發酵遲緩甚至發酵停止的風險增加。缺乏營養也可能產生一些不良的風味物質，如硫化氫、乙酸等物質，從而影響葡萄酒的香氣質量[4-5]。葡萄汁的含糖量越高，酵母將葡萄汁中的糖全部代謝轉化成酒精所需要的營養物質也越多[6-7]。影響葡萄酒發酵的主要因素為葡萄汁中YAN的含量，葡萄汁中的YAN主要包括銨離子、α-氨基酸和小肽。在發酵的早期階段，酵母迅速吸收積累這些營養物質，從而滿足酵母代謝相關的蛋白質合成和生長所需的營養物質，剩余YAN則儲存在細胞液泡中[8-9]。在實際生產過程中，釀酒師通常選擇不同的營養調整葡萄汁的營養含量，保證發酵的順利進行，向葡萄汁中添加營養物質不僅改善酒精發酵，還能提高葡萄酒品質[10]。

由于全球氣候變暖，葡萄中的含糖量不斷升高，在我國新疆、寧夏等釀酒葡萄主產區，葡萄的含糖量到達280 g/L以上屢見不鮮，而釀造這些高糖度的葡萄汁不僅需要耐酒精度高的酵母，同時也要滿足酵母對營養的需求，但這些葡萄汁中的營養往往不能滿足酵母的代謝需求。

在含氮量不足的情況下，為了避免發酵出現停滯等現象，應適當調整葡萄汁的營養成分，保證發酵順利的進行。安琪發酵營養NutrienFast是含有酵母制品、磷酸氫二銨以及酵母需要的微量營養物質，添加100 mg/L的安琪發酵營養NutrienFast將會增加13～14 mg/L YAN。本實驗在缺乏營養且含糖量在280 g/L的葡萄汁中進行，通過在不同的發酵時期添加發酵營養劑NutrienFast，研究其對葡萄酒酒精發酵的影響，以期解決或預防葡萄酒的發酵停止或停滯問題，提高葡萄酒的品質。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

安琪葡萄酒酵母、安琪發酵營養劑NutrienFast：安琪酵母股份有限公司。

葡萄汁：赤霞珠葡萄除梗、破碎，添加30 mg/L果膠酶（商業果膠酶，按照說明書用量使用），在4 ℃條件下冷浸漬24 h，分離葡萄汁和葡萄皮渣，然后用0.8 g/L的皂土進行下膠處理，48 h后分離上清葡萄汁，葡萄汁的糖度用葡萄糖調節至280 g/L，相對密度1 118，用酒石酸調節pH為3.6，酵母可同化氮為180 mg/L。

1.2 儀器與設備

Chromaster系列5210高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：日立高新技術公司；PH-3C pH計：上海儀電科學儀器股份有限公司；BSA3202S電子天平：賽多利斯科學儀器有限公司；HGZN-32電熱恒溫干燥箱、HPX-Ⅱ300恒溫生化培養箱：上海躍進醫療器械有限公司；DMA35 便攜式密度計：奧地利Anton Paar（安通帕）公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 葡萄酒發酵方法

將500 mL葡萄汁裝入500 mL三角瓶中，三角瓶用U型單向閥封口，單向閥中加入1.5 mL水密封，CO2能正常溢出，同時防止氧氣進入，模擬葡萄酒的厭氧發酵。

酵母活化：酵母的用量為250 mg/L，用10倍酵母質量、溫度35～40 ℃、含有5%葡萄糖水溶液活化酵母20 min，活化后加入裝有500 mL葡萄汁的三角瓶中，將三角瓶置于25 ℃恒溫培養箱中發酵17 d，分別在發酵第0、1、2、3、4、6、7、8、9、10、11天添加0.4 g/L安琪發酵營養NutrienFast。每天測定CO2的質量損失。

發酵完成后放入4 ℃冰箱中，待酵母沉降后，分離上清液，檢測葡萄酒的相對密度、酒精度、殘糖。剩余的酵母沉降物用濾紙分離酵母，將分離后的酵母，放入105 ℃烘箱中烘干至恒質量，稱量酵母的干質量。

1.3.2 測定方法

葡萄酒的相對密度：使用DMA35 便攜式密度計測定；葡萄酒酒精度、殘糖：按照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》進行測定[11]。

CO2質量損失：添加酵母后，用單向閥封口，稱量原始質量，每天用分析天平稱量整個發酵體系的質量。計算公式如下：

2 結果與分析

2.1 發酵營養劑NutrienFast的添加時期對酵母發酵進程的影響

在葡萄酒生產中影響酵母發酵進程的主要因素是營養物質的含量和種類，其中葡萄汁中YAN的含量是影響葡萄酒發酵進程的主要因素[12]。研究發現，酵母提供氮素營養和其他營養物質能提高酵母對酒精的耐受性[13-14]，改善葡萄汁中營養成分對葡萄酒的香氣物質的種類和濃度的影響[15-17]。酵母不同的生長階段對營養的需求不同，本研究是通過在酵母發酵不同的階段添加發酵營養劑NutrienFast，研究營養對酒精發酵代謝的影響，結果見表1。

表1 發酵營養劑NutrienFast添加時間對發酵結束后CO2累積質量損失的影響Table 1 Effect of fermentation nutrient agent NutrienFast addition time on CO2 cumulative mass loss after fermentation

由表1可知，與對照（未添加營養）相比，在發酵不同時期添加安琪發酵營養NutrienFast，CO2累積質量損失均有所提高，其中在發酵第3天（糖消耗36.26%）、第4天（糖消耗44.18%）時添加安琪發酵營養NutrienFast，CO2累積質量損失最高，分別為129.62 g/L、128.82 g/L，說明此時添加安琪發酵營養NutrienFast發酵最徹底；這一階段是酵母生長的穩定期，其他研究發現穩定期添加營養對酵母的蛋白質合成和糖的轉運具有積極顯著的促進效果[18]。發酵第4天后添加安琪發酵營養NutrienFast對發酵的促進作用減弱，在發酵第11天（糖消耗73.95%）時添加安琪發酵營養NutrienFast，對發酵的影響最弱。

2.2 發酵營養劑NutrienFast添加時期對酵母生物量的影響

本研究中酵母接種量為250 mg/L，接種后的酵母活細胞數為6×106cells/mL。研究發現，在含有足夠營養的葡萄汁中，葡萄酒發酵完成后，酵母數量能達到108個細胞/mL左右，酵母生物量能達到3～5 g/L，若葡萄汁中的營養不足，酵母數量和酵母干質量均受到影響[19-20]。

在不同時期添加發酵營養劑NutrienFast對酵母細胞干質量的影響見圖1。由圖1可知，與對照（未添加營養）相比，發酵前6 d（糖消耗≤56.46%）添加營養都能明顯的促進酵母的生長，發酵結束后酵母干質量均在3.2 g/L以上，其中發酵第2～4天時添加營養對酵母干質量的影響最為顯著，發酵結束后酵母干質量分別為3.53 g/L、3.57 g/L、3.62 g/L，發酵結束后酵母干質量的變化趨勢與酵母發酵速率和酵母累積質量損失的趨勢一致，因此酵母的生物量的大小影響了酵母的發酵速度，不同時期添加營養劑對酵母的生物量和酵母的發酵速度具有不同的影響，在YAN不足的發酵中，不僅需要添加營養劑，還需要確定最佳的營養劑添加時期，才能達到最佳的應用效果。MENDES-FERREIRA A等[21]的研究發現，YAN通過增加酵母生物量、刺激酵母對糖的利用影響葡萄酒的發酵，添加氮素營養導致了細胞數量的增加，增加了比發酵速率，從而縮短了發酵的時間。

圖1 營養添加時間對發酵結束后酵母干質量的影響Fig.1 Effect of nutrition addition time on yeast dry mass after fermentation

2.3 營養添加時期對葡萄酒理化指標的影響

2.3.1 營養添加時期對葡萄酒相對密度的影響

發酵結束后葡萄酒的相對密度越低，表示葡萄酒中的殘糖含量越低，酒精度越高。

從圖2可以看出，在發酵第3天和第4天時添加安琪發酵營養NutrienFast葡萄酒相對密度最低，分別為991和990.5。在發酵過程中酵母的生長時期主要包括遲滯期、指數生長期，穩定期和消亡期。在遲滯期，酵母需要適應葡萄酒的發酵環境，然后酵母進入指數生長期，此時酵母快速繁殖，大量的吸收葡萄汁中的營養物質，當酵母指數生長期結束時，對應糖消耗大約為30%[22]，此時若葡萄汁中缺乏營養將導致發酵不完全，因此在發酵進行到30%左右添加營養對發酵具有明顯的促進作用。本研究在發酵進行到第3天和第4天時添加營養，發酵完成后的相對密度最低，此時的發酵進行到35%～45%之間，該時期添加營養對酵母的影響最大。

圖2 營養添加時間對發酵結束后葡萄酒相對密度的影響Fig.2 Effect of nutrition addition time on specific gravity of wine after fermentation

2.3.2 營養添加時期對葡萄酒殘糖含量的影響

圖3表示了不同時期添加營養對最終葡萄酒中殘糖的影響，發酵第3天和第4天時添加安琪發酵營養NutrienFast，葡萄酒殘糖最低，分別為3.38 g/L和3.68 g/L，均低于4 g/L，說明發酵完全，而其他時期添加營養均不能發酵完全，添加過早或過晚均不能使酵母很好的代謝葡萄汁中的糖。發酵進行到30%～40%時，酵母到達穩定期階段，在這一階段添加營養，一方面對發酵速度影響非常顯著，該時期添加營養會減少發酵時間，促進酵母發酵速度，快速完成發酵[23]。從圖3可以看出，第3天和第4天添加營養的發酵中發酵完成，其他時期添加營養的發酵中糖均高于4 g/L，因此均未完成發酵。

圖3 營養添加時間對發酵結束后葡萄酒殘糖含量的影響Fig.3 Effect of nutrition addition time on residual sugar content of wine after fermentation

2.3.3 營養添加時期對葡萄酒酒精度的影響

圖4顯示了不同營養添加時期對最終葡萄酒酒度的影響，發酵第3天和第4天時添加安琪發酵營養NutrienFast，發酵結束后葡萄酒的酒精度最高，分別為16.5%vol和16.4%vol。本實驗中葡萄汁中的糖含量為280 g/L，YAN為180 mg/L，葡萄汁中缺乏營養，不能完成葡萄酒的發酵，因此需要添加營養物質使酒精發酵完全。研究發現氮素的缺乏導致酵母的代謝活性和生物量降低[8-9，24]，引起酵母發酵困難，從而出現發酵停滯的風險，本研究中在缺乏營養的葡萄汁發酵的不同時期添加營養物質，結果顯示，在發酵中期（35%～45%）添加營養，葡萄酒中的酒精度達到最高，且含糖量低于4 g/L，符合國家標準對干型葡萄酒的要求。因此推薦該時期作為補充營養的最佳時期，在缺乏營養的葡萄汁中通過補充營養物質來防止發酵緩慢或停滯[25]。

圖4 營養添加時間對發酵結束后葡萄酒酒精度的影響Fig.4 Effect of nutrition addition time on alcohol content of wine after fermentation

3 結論

本研究從CO2累積質量損失、最終酵母干質量，葡萄酒的理化指標等方面評價不同時期添加安琪發酵營養NutrienFast對葡萄酒發酵的影響。結果表明，在發酵第3天（糖消耗36.26%）、第4天（糖消耗到達44.18%）時添加營養對發酵的影響最大，此時CO2累積質量損失最高，分別為129.62 g/L和128.82 g/L；酵母干質量最高，分別為3.57 g/L、3.62 g/L；葡萄酒相對密度最低，分別為991和990.5；殘糖最低，分別為3.38 g/L和3.68 g/L；酒精度最高，分別為16.5%vol和16.4%vol；且酒精發酵完全（殘糖分別為3.38g/L和3.68 g/L，均＜4 g/L，符合國家標準對干型葡萄酒的要求，因此在發酵第3～4天（發酵進行到35%～45%之間）添加營養物質可有效解決或者預防葡萄酒的發酵停止或停滯的問題，使發酵完全達到國家對干型葡萄酒的要求。本研究中還缺乏添加營養對葡萄酒香氣的影響，需要在后期進行深入的研究。