響應面法優化鼠李糖乳桿菌發酵藍靛果產多酚工藝

王雪萌，裴芳藝，任焱鑫，曹鑫博，葛菁萍*

（1.黑龍江大學 生命科學學院 微生物黑龍江省高校重點試驗室，黑龍江 哈爾濱 150080；2.黑龍江大學 農業微生物技術教育部工程研究中心，黑龍江 哈爾濱 150500）

植物多酚（polyphenols）是一種通過植物次生代謝，由磷酸戊糖、草酸鹽和苯丙烷途徑合成的一種酚性羥基有機化合物[1]，可根據結構和化學性質分為黃酮類和非黃酮類[2]，具有良好的抑菌消炎、降糖脂、抗動脈硬化等功能[3-6]。植物多酚在果實中主要以兩種形式存在-結合多酚（纖維素-多酚、果膠-多酚、木質素-多酚等）和游離多酚[7]，其作為人類第7營養素具有來源廣泛（茶葉、葡萄、松樹和菜籽等）、儲藏量大等優點[8-10]，但是不同來源多酚的有效利用率低，很難投入到大規模工業生產化中，因此，挖掘不同植物源的多酚，并對其產游離態多酚發酵條件的優化成為目前的研究熱點。

藍靛果（Lonicera caerulea）是一種位于冷涼濕潤性氣候的具有重要經濟價值的藍色小漿果，多年生灌木植物，高度抗寒，種植地區具有區域性[11]，其中多酚作為藍靛果中重要的活性物質，其含量（865mg/100g）均高于常見的小漿果，如黑加侖（812 mg/100 g）、藍莓（684 mg/100 g）、樹莓（333 mg/100 g）等[12]，目前，常見的多酚轉化方法主要有物理法、化學法及微生物轉化法，與前兩種轉化技術相比[13]，微生物轉化法通過化學結構修飾[14]、多種生物化學反應[15]等途徑將結合態多酚轉化為游離態多酚，以提高游離多酚利用率，具有綠色、安全及副產物少等特點[16-18]。近年來，微生物轉化法中采用的微生物主要為乳酸菌屬[19]、芽孢桿菌屬[20]及腐生菌屬[21]等。研究發現，通過紅曲霉和芽孢桿菌混合發酵番石榴葉，游離態多酚含量顯著提高，其游離態多酚組分中槲皮素含量提升最為顯著[22]；以乳酸菌為發酵菌株對獼猴桃果汁進行發酵條件優化，相比于獼猴桃原汁游離態多酚中總黃酮含量提高25.45%[23]。

目前，鮮見通過鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）發酵藍靛果多酚的報道，本研究通過Lactobacillus rhamnosusCICC6224發酵藍靛果產多酚，并采用單因素試驗結合響應面法對其發酵工藝進行優化，以期為微生物發酵應用果蔬益生元開發及利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗菌株及材料

鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）CICC6224：保藏于中國工業微生物菌種保藏管理中心（China center of industrial culture collection，CICC）；蓓蕾藍靛果果實：東北農業大學。

1.1.2 化學試劑

乙酸鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸錳、檸檬酸氫銨、葡萄糖、吐溫-80（均為分析純）：天津市科密歐化學試劑有限公司；牛肉膏、酪蛋白胨、酵母提取物（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術有限責任公司；福林酚、沒食子酸（均為分析純）：上海源葉生物科技有限公司。其他試劑均為國產分析純。

1.1.3 培養基

發酵培養基：藍靛果去梗后，用去離子水清洗藍靛果表面，擦拭藍靛果表面水分，熱吹風機干燥處理，使用打漿機將藍靛果進行破碎，收集樣品，108 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，滅活藍靛果果汁中的酶、有害雜菌。

馴化培養基[24]：將發酵培養基與MRS培養基按體積比1∶1混合，108 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

L3-LJ170榨汁機：山東九陽股份有限公司；SW-CJ超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；UltraGEM2超純水器：英國ELGA LabWater公司；MLS-3780 SANYO蒸汽壓力滅菌鍋：上海精宏實驗設備有限公司；ZHWY-211C恒溫培養振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；FE20 pH Meter pH計：梅特勒-托利多上海有限公司；UVmini-1240紫外可見分光光度計：島津國際貿易上海有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種的馴化

將L.rhamnosusCICC6224菌液以2%（V/V）的接種量接種于馴化培養基，37 ℃、140 r/min培養24 h，得到馴化菌液。

1.3.2 鼠李糖乳桿菌發酵藍靛果產多酚發酵條件優化單因素試驗

將L.rhamnosusCICC6224馴化菌液按2%（V/V）的接種量接種于裝液量為50 mL發酵培養基（藍靛果與水的質量體積比為1∶3（g∶mL））的250 mL三角瓶中，37 ℃條件下發酵24 h。在此基礎上，采用單因素輪換法依次考察不同料液比（1∶5、1∶4、1∶3、1∶2、1∶1）（g∶mL）、接種量（1%、2%、3%、4%、5%）、裝液量（30 mL、50 mL、70 mL、90 mL、110 mL）、發酵溫度（25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃）、發酵時間（18 h、24 h、30 h、36 h、42 h）對發酵液中多酚含量的影響，確定最佳發酵條件。

1.3.3 鼠李糖乳桿菌發酵藍靛果產多酚發酵條件優化響應面試驗

（1）Plackett-Burman試驗設計

根據單因素試驗的結果，選擇影響多酚含量的5個因素（發酵溫度、裝液量、發酵時間、接種量、料液比），以多酚含量（Y）為響應值，利用Design Expert 10軟件設計5因素3水平的PB試驗，PB試驗設計因素與水平見表1。

表1 Plackett-Burman試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments design

（2）最陡爬坡試驗

在PB試驗的基礎上，選取影響較大的因素，根據其正負效應設計最陡爬坡試驗。

（3）中心組合試驗設計

根據PB試驗及最陡爬坡試驗結果，以多酚含量（Y）為響應值，以發酵時間（A）、接種量（B）、料液比（C）為考察因素，應用Design Expert 10軟件設計中心組合設計（central composite design，CCD）試驗，試驗設計因素與水平見表2。

表2 中心組合試驗設計因素與水平Table 2 Factors and levels of central composite experiments design

1.3.4 多酚含量的測定

多酚含量的測定參照ZHENG Y等[25]的方法進行改良。通過福林-酚法測定多酚含量，以沒食子酸含量（X）為橫坐標，吸光度值（Y）為縱坐標，繪制沒食子酸標準曲線，得到沒食子酸標準曲線回歸方程為：Y=1.353 8X+0.003 6，R2=0.998 1。根據標準曲線回歸方程計算發酵液中多酚的含量。

1.3.5 數據處理

每組試驗設計3組平行試驗，結果以“平均值±標準差”表示，采用Design Expert 10、IBM SPSS Statistics 27、Origin 2021設計試驗、分析數據及作圖。

2 結果與分析

2.1 鼠李糖乳桿菌發酵藍靛果產多酚發酵條件優化單因素試驗結果

不同發酵條件對L.rhamnosusCICC6224發酵藍靛果產多酚的影響見圖1。藍靛果果漿中的一些營養物質（如糖類、蛋白質等）是L.rhamnosusCICC6224發酵的主要底物，通過持續加水不僅使得榨取藍靛果果漿更為細膩，而且緩解了發酵液中過高的滲透壓對菌株生長的影響，但過低的料液比稀釋了發酵液中的糖類等營養物質，無法維持菌株的自身生長，不利于發酵[26]，由圖1A可知，隨著料液比的升高，多酚含量呈先升高后降低的趨勢，當料液比為1∶3（g∶mL）時，多酚含量最高，為（1 014.43±18.56）mg/100 g，因此，確定最佳料液比為1∶3（g∶mL）。

L.rhamnosusCICC6224通過微生物修飾作用將結合酚轉化為游離酚，當菌株密度過高時，發酵液中的底物無法為菌株的生長提供充足的營養物質，導致過多的菌株利用游離酚作為碳源來維持自身生長[27]。由圖1B可知，隨著接種量的升高，多酚含量呈先升高后下降的趨勢，說明接種量過低及接種量過高均不利于發酵液中多酚的積累，當接種量為3%（V/V）時，多酚含量最高，為（1 074.62±17.60）mg/100 g，因此，確定最佳接種量為3%（V/V）。

L.rhamnosusCICC6224為好氧微生物，裝液量的升高為菌株生長提供了充分的底物，但同時也減少了錐形瓶中氧氣的含量，裝液量過多不利于菌株的正常生長，從而影響多酚的轉化[28]。由圖1C可知，隨著裝液量的升高，多酚含量呈先升高后下降的趨勢，當裝液量為70 mL時，多酚含量最高，為（1 162.16±22.14 mg/100 g），因此，確定最佳裝液量為70 mL。

圖1 料液比（A）、接種量（B）、裝液量（C）、發酵溫度（D）及發酵時間（E）對多酚含量的影響Fig.1 Effect of material and liquid ratio (A),inoculum (B),loaded liquid (C),fermentation temperature (D) and fermentation time (E) on polyphenolic content

培養溫度的變化影響了菌株的生長，溫度的升高和發酵過程中酒精等發酵產物的積累降低了多酚的轉化速度[29]。由圖1D可知，隨著發酵溫度的升高，多酚含量呈先升高后下降的趨勢，當發酵溫度為35 ℃時，多酚含量最高，為（1 140.27±23.32）mg/100 g，因此，確定最佳發酵溫度為35 ℃。

在發酵過程中，菌株通過利用發酵液的底物進行繁殖傳代，通過微生物作用轉化多酚類物質的組分，但營養物質的含量隨著發酵時間的增加而減少，部分菌株賴以生長的碳源由糖類轉變為游離酚，多酚的積累量逐漸減少[30]。由圖1E可知，隨著發酵時間的延長，多酚含量呈先升高后下降的趨勢，當發酵時間為30 h時，多酚含量達到最高，為（1 211.40±23.62）mg/100 g，因此，確定最佳發酵時間為30 h。

綜上，選取料液比1∶3（g∶mL）、接種量3%（V/V）、裝液量70 mL、發酵溫度35 ℃和發酵時間30 h為最佳發酵條件。

2.2 PB試驗結果及分析

根據單因素試驗結果，以多酚含量（Y）為響應值，設計PB試驗，試驗設計及結果見表3，方差分析結果見表4。

表3 Plackett-Burman試驗設計與結果Table 3 Design and results of Plackett-Burman experiments

表4 Plackett-Burman試驗結果方差分析Table 4 Variance analysis of Plackett-Burman experiments results

采用Design Expert 10軟件對表3試驗結果進行多元回歸擬合，得到各變量與多酚物質含量關系的模型擬合方程為Y=1 142.78+1.47X1-5.97X2+19.62X3+20.07X4+43.18X5，其中X1、X3、X4、X5對試驗結果呈正效應，X2呈負效應。由表4可知，回歸模型極顯著（P＜0.01），決定系數R2值為0.937 5，表明93.75%的變異都可以用此方程估測。由表4亦可知，X3、X4、X5對結果影響顯著（P＜0.05），其他因素對結果影響不顯著（P＞0.05）。

2.3 最陡爬坡試驗

根據PB試驗結果設計最陡爬坡試驗，其試驗設計及結果見表5。由表5可知，試驗4條件下，即發酵時間28 h，接種量3.4%，料液比1∶2.6（g∶mL）時，鼠李糖乳桿菌CICC6224發酵藍靛果發酵液中多酚含量最高，達到1 397.44 mg/100 g，因此選取該處理中各變量取值作為CCD試驗中心點進行后續優化試驗。

表5 最陡爬坡試驗設計及結果Table 5 Design and results of the steepest ascent test

2.4 響應面試驗結果及分析

CCD試驗設計及結果見表6，方差分析結果見表7。

表6 中心組合試驗試驗設計及結果Table 5 Design and results of central composite experiments

表7 中心組合試驗試驗結果的方差分析Table 7 Variance analysis of central composite experiments results

采用Design Expert 10軟件對表6試驗結果進行多元二次回歸擬合，得到各因素對多酚含量的多元二次擬合回歸方程為Y=1583.14+38.99A+31.01B+48.51C-21.89AB-39.67AC-5.47BC-47.36A2-47.36B2-24.08C2。由表7可知，模型極顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（P＞0.05），說明回歸模型擬合性較好，模型可靠。決定系數R2=0.908 6，調整決定系數R2Adj=0.817 1，說明81.71%的試驗數據的變異性可用此回歸模型解釋。由表7亦可知，一次項A、C和二次項A2、B2對結果影響極顯著（P＜0.01），一次項B及交互項AC對結果影響顯著（P＜0.05），其他項對結果影響不顯著（P＞0.05）。

各因素間交互作用對多酚含量影響的響應面及等高線見圖2。由圖2可知，響應曲面開口均朝下，存在最高點，其中交互項AC的等高線呈橢圓形，說明對結果影響顯著，與方差分析結果一致。

圖2 發酵時間、接種量和料液比對游離多酚含量影響的等高線及響應曲面Fig.2 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between fermentation time,inoculum and material-liquid ratio on free polyphen production

2.5 驗證試驗

采用IBM SPSS Statistics 27軟件對回歸方程進行求解，得到最優發酵工藝條件為：發酵時間27.74 h、接種量3.43%、料液比1∶2.49（g∶mL），多酚含量的預測值為1 619.83 mg/100 g，為便于實際操作，將最優條件修整為發酵時間28 h、接種量3.4%和料液比1∶2.5（g∶mL），在此條件下進行5次驗證試驗，測得發酵液中的多酚含量為（1 622.54±16.71）mg/100 g，試驗值與預測值接近，結果可靠。

3 結論

本研究以多酚含量為響應值，采用單因素試驗結合響應面試驗優化得到鼠李糖乳桿菌CICC6224發酵藍靛果產多酚的最優發酵條件為發酵溫度35 ℃、裝液量70 mL、發酵時間28 h、接種量3.4%、料液比1∶2.5（g∶mL），在此條件下，多酚含量達到1 622.54 mg/100 g，是優化前（711.64 mg/100 g）的2.28倍。本試驗證實通過鼠李糖乳桿菌CICC6224發酵是一種提高藍靛果果漿中游離多酚含量的有效途徑，這為微生物法大量富集游離多酚提供了理論依據，同時進一步為食品級開發藍靛果生物活性物質成分與功能提供基礎保障。