基于錫林郭勒草原本地乳酸菌的高脂型浩乳德的研發

王福超，徐偉良，李春冬，張 華，牧其爾，雅 梅，郭 梁*

（1.錫林郭勒職業學院 生物工程研究院，內蒙古 錫林浩特 026000；2.延邊大學 農學院，吉林 延吉 133002）

蒙古族傳統乳制品蘊含著蒙古族豐富的傳統文化，有著上千年的歷史。其種類繁多、奶香濃郁、營養價值高，主要有浩乳德（奶豆腐）、畢希拉格（熟奶豆腐）、阿爾沁浩乳德（酸奶酪）、烏乳穆（奶皮子）、嚼克（稀奶油）、希日陶蘇（黃油）、額德森蘇（天然酸奶）和策格（酸馬奶）等[1-2]。浩乳德來自蒙古語，中文名為奶豆腐，是蒙古族最為常見的一種乳制品。浩乳德通常是用牛乳經過自然發酵、凝乳、排除乳清、再加熱攪揉成型制作而成的食物。其形狀和普通豆腐相似，且多為乳白色，呈長方體或正方體。常以奶茶為伴，味微酸，其中拔絲浩乳德，更是內蒙古的特色佳肴。浩乳德以內蒙古中東部的察哈爾民族制作時間最早、產品種類最多、制作工藝最優、風味與營養最佳，曾更是以貢品而進獻歷代皇帝，是具有一定代表性和重要性的中國傳統乳制品[3]。蒙古族傳統乳制品含有大量的蛋白質、脂肪酸、維生素、鈣、磷及微量元素，且不飽和脂肪酸和人體必需氨基酸含量較高，是老人、小孩補充鈣、磷、鋅等元素的絕好食物[4]。蒙古族傳統乳制品不僅含有大量營養成分和特色風味物質，更蘊含著豐富的益生菌資源，對營養保健功能食品和商業發酵菌劑的開發具有巨大潛力，逐漸成為益生菌資源研究的熱點[5]。目前針對傳統浩乳德研究主要集中在儲藏[6-7]、菌群[8-11]以及功能微生物[12-14]的研究。內蒙古農業大學雙全教授在蒙古族傳統浩乳德工業化生產[15]以及發酵保護劑優化[16-17]等方面做了開拓性的研究。現已有報道從傳統浩乳德中分離獲得乳酸片球菌（Pediococcusacidi lactici）、鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）等具有益生活性的乳酸菌[18-20]。王曉宇等[15]研究表明，利用篩選所得菌種研發的菌劑進行工業化生產奶豆腐時，最終奶豆腐出成率可達8.31%。李偉程等[21]對傳統發酵酸牛奶、酸馬奶和酸駝奶中益生菌的微生物多樣性進行研究，發現發酵酸牛奶中細菌屬以乳球菌屬為主。莫藍馨[22]以采集自內蒙古錫林郭勒盟的12份酸馬奶和蒙古國巴彥洪格爾省的酸馬奶、酸牛奶和奶酪等16份傳統發酵乳制品樣品為研究對象，共分離鑒定得到105株乳酸菌，其中優勢菌為瑞士乳桿菌和馬乳酒樣乳桿菌。

目前，蒙古族傳統乳制品的生產以家庭式或作坊式為主，缺乏統一的工藝技術標準和產品，品質差異很大且相關理論的研究較少。從市場中生產者需求和傳統工藝流程來看，自然發酵生產狀態是影響標準化生產的最大阻礙。由于自然發酵無法滿足發酵時間和凝乳品質的標準化以及微生物安全，因此嚴重制約了產品的市場銷售范圍，前期研究甚至發現自然發酵會引入青霉屬和曲霉屬等有害真菌[23]。因此，本研究以前期從蒙古族自然發酵乳中分離、純化、初步篩選得到乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）XM-001和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）XM-002，對其進行產酸凝乳和產雙乙酰能力評價，通過篩選評價和菌株復配，用于研發一款高脂型浩乳德產品，不但能夠保證菌株來源的安全性和穩定性，而且也為浩乳德的標準化生產以及工業生產標準的制定提供有益借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗材料

乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）XM-001和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）XM-002：錫林郭勒職業學院篩選及保藏；全脂滅菌純牛奶（蛋白質3.2 g、脂肪3.8 g、碳水化合物4.8 g）：伊利集團；市售生鮮乳：錫林浩特市市場；商用菌劑1（由保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、乳酸乳球菌乳酸亞種、乳酸乳球菌乳脂亞種、乳酸乳球菌雙乙酰亞種、腸膜明串珠菌腸膜亞種、嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌、長雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌10種混合菌組成，菌活力達108CFU/g）、商用菌劑2（由杜邦-丹尼斯克的酸奶發酵菌組成，菌活力達108CFU/g）：昆山佰生優生物科技有限公司。

1.1.2 化學試劑

雙乙酰標準品（純度99.9%）：北京普慧智遠生物科技有限公司；鄰苯二胺、酚酞、氫氧化鈉（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3 培養基

MRS固體培養基：北京路橋技術股份有限公司。

1.2 儀器與設備

HWS-250BX恒溫恒濕培養箱：天津市泰斯特儀器有限公司；SW-J-2FD雙人單面垂直凈化工作臺：蘇州博萊爾凈化設備有限公司；AXTG16G臺式高速離心機：鹽城市安信實驗儀器有限公司；UV9100A紫外分光光度計：北京萊伯泰科儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株產酸凝乳能力評價

對菌株XM-001、XM-002、XM-001和XM-002復合菌1∶1進行產酸凝乳評價，并以兩種商用菌劑為陽性對照，以全脂滅菌純牛奶為陰性對照（CK），進行產酸凝乳能力評價。在25 ℃的條件下，發酵24 h，并以發酵酸度（吉爾涅爾度，°T）及最終常溫凝乳狀態（有無凝乳，凝塊是否均勻、潤滑，乳清是否析出）和感官風味等綜合因素作為評價標準。

1.3.2 雙乙酰風味物質測定

雙乙酰標準曲線：取12支編號的試管分成2排放置，取一定量的雙乙酰標準品溶液，并用8%三氯乙酸溶液補足10 mL，使雙乙酰標準溶液的最終質量濃度為0、3.0 μg/mL、6.0 μg/mL、9.0 μg/mL、12.0 μg/mL和15.0 μg/mL。以雙乙酰質量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標繪制標準曲線。

樣品前處理：取15 mL自然發酵凝乳樣品于50 mL離心管，加入15 mL 16%三氯乙酸溶液，顛倒混勻后4 000 r/min離心10 min，使用濾紙進行過濾，濾液為待測樣品。同時，以全脂滅菌純牛奶作為陰性對照。

雙乙酰的測定[24]：準備12支15 mL試管分兩排，第一排試管中加入0.5 mL 1%的鄰苯二胺溶液，第二排試管為空白不加鄰苯二胺溶液；搖勻后置于黑暗處放置30 min。待反應完全后第一排試管加2.0 mL濃度為4.0 mol/L的鹽酸終止反應，第二排試管加2.5 mL鹽酸，混勻后以第二排試管作為空白參比液，用石英比色皿在波長335 nm處測定吸光度值。取通過前處理的發酵乳樣品，用8%的三氯乙酸溶液稀釋3倍，重復上述實驗步驟，然后代入雙乙酰標準曲線回歸方程中計算樣品的雙乙酰質量濃度。

1.3.3 浩乳德加工工藝流程及操作要點

將篩選得到乳酸乳球菌XM-001和植物乳桿菌XM-002，按照1∶1的比例混合制成復合菌劑加入到高溫滅菌后的牛奶中在常溫條件下進行自然發酵，并將發酵凝乳用于浩乳德的制作。具體制作工藝流程見圖1。

圖1 浩乳德制作流程Fig.1 Production process of Hurood

1.3.4 分析檢測

將制作完成的浩乳德放在陰涼干燥環境下晾曬16 h后計算浩乳德得率（浩乳德得率=浩乳德成品質量/原料乳的質量×100%）。隨機抽選15位具有食品感官評定資質的檢測人員，從外觀色澤、口感、氣味、組織狀態和融水狀態5個方面對浩乳德進行感官評價[15]，滿分100分，感官評價標準見表1。

表1 浩乳德感官評價標準Table 1 Sensory evaluation standards of Hurood

浩乳德水分、蛋白質和脂肪檢測分別按照GB 5009.3—2016《食品中水分的測定》[25]、GB 5009.5—2016《食品中蛋白質的測定》[26]、GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測定》[27]中的方法進行測定。

1.3.5 數據統計分析采用SPSS Statistics 20.0軟件進行數據的統計分析，進行相關性分析，實驗結果以“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 產酸凝乳能力評價結果分析

產酸凝乳能力是乳制品生產加工中常用于評價菌株活力和篩選良好發酵性能的重要參考依據之一。乳制品在發酵過程中菌株會將乳中的蛋白質、乳糖等逐漸分解不僅產生氨基酸和乳酸等營養成分，還能為發酵乳賦予一些獨特的風味物質，如雙乙酰、乙醛、乙偶姻、有機酸、脂肪酸等[28]。鮮奶中的乳糖被乳酸菌發酵生成乳酸、乙酸、檸檬酸等有機酸，能夠降低胃腸道pH，抑制腸道病原菌，調節腸道菌群平衡[29]。因此，乳酸菌的產酸能力是評價其活力和篩選優良菌株的重要指標。凝乳能力也是作為酸奶等乳制品生產的關鍵環節，在生產凝乳制品的過程中，多依靠控制凝乳過程及性質來調控乳制品質構與風味特征的目的[30-31]。尤其是在蒙古族傳統乳制品的制作過程中，凝乳程度是影響產品品質的關鍵因素之一，一般會通過調控加熱凝乳過程來達到可控的產品風味與品質[32]。本研究對菌株XM-001、菌株XM-002及商用菌劑進行產酸凝乳評價，結果見表2。

表2 不同菌株產酸凝乳能力評價結果Table 2 Evaluation results of ability of acid production and milk curdling by different strains

由表2可知，發酵24 h后，菌株XM-001酸度可達（84.30±4.16）°T；菌株XM-002酸度為（36.00±2.08）°T，二者相比，菌株XM-001產酸快，凝乳狀態較好，感官風味好；復合菌酸度可達（88.00±4.00）°T。商用菌劑1酸度為（69.30±1.10）°T，商用菌劑2酸度為（63.00±1.21）°T。與兩種商用菌劑比，菌株XM-001凝乳狀態很好，產酸遠高于商用菌劑，但感官風味略差。菌株XM-002感官風味與商用菌劑相似，而凝乳狀態和酸度次于商用菌劑；將菌株XM-001和XM-002用1∶1的比例進行復配，其酸度可達（88.00±4.00）°T，感官評分達90分。結果表明，菌株XM-001是具有較強發酵能力的乳酸乳球菌，菌株XM-002是感官風味較好的植物乳桿菌。二者復配后產酸凝乳和感官風味均有較好提升。

2.2 雙乙酰含量測定結果分析

雙乙酰被認為是產生乳制品奶油香味的主要物質[24]，也是評價發酵奶制品的一個關鍵因素。測定結果見表3。

表3 不同菌株制備浩乳德中雙乙酰含量測定結果Table 3 Determination results of diacetyl contents in Hurood prepared by different strains μg/mL

由表3可知，菌株XM-001發酵24 h后的雙乙酰含量為（21.40±1.36）μg/mL，菌株XM-002發酵24 h后的雙乙酰含量為（23.90±4.05）μg/mL，二者復合配比后的菌劑雙乙酰含量可達（24.60±0.77）μg/mL，由此可知，復配后菌株的雙乙酰含量有所提升，但提升并不顯著。而商用菌劑1和商用菌劑2的雙乙酰含量分別為（38.00±1.71）μg/mL、（32.56±4.62）μg/mL，均高于本研究所篩選菌株的產雙乙酰含量，這可能是由于兩種商用菌劑均是多種菌株復配所得，因此在多種菌株共同作用下加快了風味代謝反應，促進雙乙酰等風味物質的產出，所以整體雙乙酰含量比本研究所得單株菌偏高。

2.3 浩乳德品質分析

2.3.1 浩乳德的產率及感官評價

由表4可知，采用菌株XM-001和XM-002復合菌株（1∶1）發酵制作的浩乳德感官評分為（85.2±1.91）分，復合菌劑生產的浩乳德與自然發酵制得的浩乳德產品相比，整體感官評分較好，質地光滑，組織較細膩，具有突出的脂香風味，但所制得浩乳德融水狀態略差，受熱易分散。經計算制得浩乳德產品平均得率為（9.4±0.21）%，與王曉宇[15]利用篩選所得菌種進行工業化生產浩乳德時，通過對菌種添加量、發酵溫度、排乳清溫度以及攪和溫度進行工藝優化后，浩乳德出成率為8.31%，略低于本研究結果。由此可知，本實驗所篩選的菌種進行浩乳德制作時，產品得率有所提高，但產品整體融水狀態渾濁，受熱易分散。這可能是由于在浩乳德制作過程中上層乳脂析出較少，使得最終產品中含脂率偏高。因此推斷本復合菌種有利于生產高脂型浩乳德產品。

表4 浩乳德產品得率與感官評分Table 4 Yield and sensory score of Hurood product

2.3.2 浩乳德理化指標

由圖2可知，菌株XM-001、XM-002復合菌株（1∶1）用復合菌劑發酵制備的浩乳德，蛋白質平均含量為（32.1±1.9）%，而傳統浩乳德中蛋白質平均含量為（32.1±2.7）%，二者含量相似，略高于地方標準DBS15/001.3—2017《食品安全地方標準蒙古族傳統乳制品第3部分：奶豆腐》要求（蛋白質含量＞26%）；用復合菌劑生產的浩乳德水分平均含量為（39.4±2.3）%，符合DBS15/001.3—2017要求（水分＜53%）[33]，而傳統浩乳德中水分含量為（55.1±3.8）%，其水分含量偏高一些，這可能與浩乳德制作工藝中晾曬脫水程度有關[34]。如浩乳德按水分含量可分為干、半干、濕三種類型，而依據產品類型的不同，浩乳德的蛋白質、脂肪、水分等營養成分指標也有所不同[35]。傳統浩乳德中脂肪平均含量為（8.4±2.2）%，復合菌劑生產的浩乳德脂肪平均含量為（22.6±2.8）%（P＜0.01）。由于本研究所使用的復合菌劑在制作浩乳德時常溫發酵18 h，酸度到65°T以上，就達到了發酵終點。菌種發酵時間短，產品出現脂肪上浮較少，使得脫脂率降低，最終所得產品脂肪含量較高。由此可以進一步推斷該復合菌劑有利于生產高脂型浩乳德，所得產品不僅脂肪等營養價值增高，更賦予了其突出的脂香風味。

圖2 浩乳德理化指標檢測結果Fig.2 Determination results of physicochemical indexes of Hurood

3 結論

本實驗通過對菌株XM-001和XM-002產酸凝乳能力和產雙乙酰風味物質評價，最終確定菌株XM-001的產酸凝乳狀態優于對照菌株，且產酸能力遠高于商用菌劑，但整體感官風味和雙乙酰含量略差。菌株XM-002發酵感官風味與商用菌劑相近，但產酸凝乳能力和雙乙酰含量次于商用菌劑，將菌株XM-001和XM-002按照1∶1比例進行復配發酵后，用此復合菌株制作浩乳德，所得產品整體得率、感官評分以及理化指標與傳統浩乳德相比均較好，其中復合菌株所生產的浩乳德的脂肪含量明顯高于傳統自然發酵生產的浩乳德，具有極顯著性差異（P＜0.01）。本實驗所使用的復合菌劑在制作浩乳德時，菌種發酵時間短，出現脂肪上浮較少，使得脫脂率降低，最終所得產品脂肪含量偏高。因此該復合菌株有利于生產高脂型浩乳德產品，而脂肪含量增加，更賦予了其濃厚的脂香風味，不但能夠保證菌株來源的安全性和穩定性，而且為浩乳德的標準化生產以及工業生產標準的制定提供有益借鑒。