結縷草屬植物表型多樣性分析及優異種質篩選

鄭榮佳， 孔維一*， 馮嘉欣， 鄭軼琦， 葉 剛， 沈澤宇， 劉建秀， 郭海林*

(1. 江蘇省中國科學院植物研究所南京中山植物園， 江蘇 南京 210014； 2. 河南科技大學， 河南 洛陽 471000)

結縷草屬植物(ZoysiaWilld.)是禾本科(Gramineae)畫眉草亞科(Eragrostoideae)的多年生C4型草本植物。我國具有豐富的結縷草屬種質資源，主要存在5個種、2個變種和1個變型，其中5個種為日本結縷草(Zoysiajaponica)、中華結縷草(Zoysiasinica)、大穗結縷草(Zoysiamacrostachya)、溝葉結縷草(Zoysiamatrella)和細葉結縷草(Zoysiatenuifolia)[1]。結縷草屬植物具有耐踐踏、耐高溫、易養護等特點，是世界上公認的優良暖季型草坪草[2]，可廣泛應用于觀賞草坪、休憩草坪、運動草坪以及保土草坪。

我國結縷草屬種質資源分布范圍較廣，適應性強，能生存于鹽堿地和荒漠等環境。由于極端生長條件的選擇壓力，以及常異花授粉特性，結縷草屬植物存在豐富的形態和遺傳變異[3]。Yaneshita等[4]和李亞等[5]分析了結縷草屬植物的形態多樣性，Lee等[6]、Hidenori等[7]和Moore等[8]則利用分子標記研究了結縷草屬植物的遺傳多樣性。開展物種表型多樣性研究有利于鑒別特異性種質資源，為挖掘植物優良基因和新品種選育奠定理論基礎[9-11]。在結縷草育種中，坪用性狀受到廣泛研究。單旭東等[12]研究發現保溫澆水處理可以明顯推遲結縷草的枯黃期，延長其青綠期。馬雪梅等[13]研究發現不同程度的踐踏脅迫顯著地影響結縷草草坪的坪用性狀，適度踐踏可控制草層高度，增加草坪密度。然而有關結縷草種子產量性狀的研究并不多。Matumura等[14]研究指出，相比于日本南方地區，日本結縷草在北方地區生產的種子產量更高。馬春暉等[15]研究不同生境對結縷草種子產量的影響，發現陽坡結縷草種子的產量明顯高于平地與陰坡。董厚德等[16]發現我國遼寧地區結縷草的種子產量明顯高于山東。郭海林等[17]通過研究68個結縷草雜交后代的繁殖性能，選育出2個坪用質量高且生長速度快的品系，以及3個種子產量高的品系。

結縷草屬植物既可營養繁殖又可種子繁殖。我國自主培育的結縷草品種主要為營養繁殖型，僅有青島結縷草為種子繁殖型。種子繁殖相對于營養繁殖具有生產成本低、草坪建植方便、運輸便利等諸多優點。隨著結縷草需求量日益增大，迫切需要培育優質高產的種子繁殖型新品種。江蘇省中國科學院植物研究所收集了國內外大量的結縷草屬種質資源，并通過雜交選育獲得一系列具有優良性狀的雜交后代。本研究以具有種子生產潛力的日本結縷草、中華結縷草、大穗結縷草種質資源和一些優異的雜交后代為試驗材料，通過對其營養性狀和生殖性狀進行觀測評價和遺傳變異分析，篩選出坪用質量高和種子產量高的特異性種質，為高產優質結縷草新品種的雜交育種提供骨干親本。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為144份結縷草屬種質資源，包含125份種源材料和19份雜交后代。125份種源材料細分成79份日本結縷草、37份中華結縷草、4份大穗結縷草、5份天然雜交結縷草，這些資源中109份為從國內收集的野生資源，其中江蘇(30份)、山東(21份)、安徽(19份)、浙江(14份)、遼寧(5份)、重慶(5份)、福建(4份)、河南(3份)、上海(3份)、北京(2份)、海南(1份)、湖南(1份)、江西(1份)，16份從國外引進，分別為日本(2份)、美國(6份)、朝鮮(8份)。19份雜交后代是本單位利用日本結縷草、中華結縷草、大穗結縷草、溝葉結縷草和長花結縷草(Zoysiasinicavar.nipponica)通過雜交選育獲得。具體材料信息見表1。

表1 供試的144份結縷草屬種質資源信息Table 1 Information of 144 Zoysia germplasm resources

續表1

1.2 試驗地概況

試驗地位于江蘇省中國科學院植物研究所草業研究中心苗圃中(32°01′N，118°48′E)，屬于北亞熱帶季風氣候，年平均氣溫為15.4℃，年最高氣溫為36℃，最低氣溫為零下9℃。氣候溫和，年平均降水量為1 013 mm，降水集中于6—9月。試驗材料種植采用盆栽法，基質為試驗地沙質土壤，肥力中等。2019年夏季取相同數量的草莖均勻種植于試驗地的花盆(高和直徑為26 cm)，每份材料設置2個重復。所有材料統一進行水肥管理、雜草清除及病蟲害防治，待草坪完全成坪后用于后續試驗。

1.3 性狀測定

本試驗于2021年5月至11月期間進行10個營養性狀和12個生殖性狀的測定。測定方法參考《植物新品種特異性、一致性和穩定性測試指南結縷草屬》[18]，并適當補充和調整，具體如下：草層高度：植物生長的自然高度，重復10次；草層密度：5 cm×6 cm小框內直立枝數目，重復3次；葉長和葉寬：直立莖從上往下第3片葉的長度和中部寬度，重復10次；葉片上表面和下表面茸毛密度：1為無或極疏，2為疏，3為密；葉舌纖毛密度：1為無或極疏，2為疏，3為密；葉色：1為淺綠色，2為綠色，3為深綠色，4為灰綠色；地下莖節間長度和直徑：地下莖第4個節的長度和中部寬度，重復10次；生殖枝高度：從地表到花序頂部的自然高度，重復10次；花序密度：5 cm×6 cm小框內花序的數目，重復5次；花序長度和寬度：花序基部小穗到頂端的長度和花序中部寬度，重復10次；穗頸長：旗葉到花序基部小穗的長度，重復10次；每穗小穗數：整個花序的小穗數目，重復10次；小穗長和小穗寬：花序中部小穗的長度和寬度，重復10次；小穗柄長：小穗基部與花序軸之間小穗柄的長度，重復10次；小穗形態：1為披針形，2為卵狀披針形，3為長卵形，4為卵形；小穗柄形態：1為直，2為彎；千粒重：隨機取100粒烘干的種子，用千分之一電子天平稱重，5個重復，取平均數后換算為1 000粒種子的重量。

1.4 數據處理

利用Excel 2016軟件對最大值、最小值、平均數、標準差進行計算，變異系數CV(%)=(標準差/平均數)×100%。用SPSS 19.0軟件計算Shannon多樣性指數[H′=-∑PilnPi](Pi為某性狀第i個品種出現的頻率)[19]，并進行主成分分析和聚類分析。

2 結果與分析

2.1 結縷草屬植物不同表型性狀之間遺傳變異分析

對144份種質資源的22個表型性狀進行變異分析，結果如表2所示，結縷草屬植物各性狀在不同材料之間具有廣泛的變異，且不同性狀的變異程度不同。生殖性狀中變異系數最大的2個性狀是穗頸長和花序密度，分別為61.48%和48.33%；其次為小穗柄形態、千粒重、小穗形態、每穗小穗數、生殖枝高度、小穗柄長、小穗長、花序長，它們的變異系數都大于20%；變異系數最小的2個性狀為花序寬和小穗寬，分別為16.62%和13.90%。營養性狀中變異系數最大的2個性狀是葉片上表面茸毛密度和草層密度，分別為47.41%和44.83%；地下莖節間直徑的變異系數最小，為15.40%；其他營養性狀的變異系數處于兩者之間。由此可見，結縷草屬植物表型性狀的變異程度較大，尤其是穗頸長、花序密度、葉片上表面茸毛密度和草層密度這4個性狀。在育種改良過程中參考這些變異大的表型性狀，有利于篩選結縷草屬植物中的優異種質。

遺傳多樣性指數可以反映植物表型性狀的遺傳多樣性[20]。由表2可知，22個表型性狀的Shannon多樣性指數有較大差異，其變化范圍為0.40～4.95，平均值為3.51，說明結縷草屬植物表型性狀的遺傳多樣性較豐富。12個生殖性狀按多樣性指數從大到小排序為穗頸長(4.86)>生殖枝高度(4.84)>每穗小穗數(4.73)>小穗柄長(4.56)>花序長(4.51)>千粒重(4.45)>小穗長(4.41)>花序寬(4.30)>花序密度(3.82)=小穗寬(3.82)>小穗形態(1.65)>小穗柄形態(0.62)。10個營養性狀按多樣性指數從大到小排序為葉長(4.95)>草層高度(4.79)=草層密度(4.79)>葉寬(4.68)>地下莖節間長度(4.55)>地下莖節間直徑(4.22)>葉色(1.17)>葉片上表面茸毛密度(0.75)>葉舌纖毛密度(0.42)>葉片下表面茸毛密度(0.40)。由此可見，生殖性狀中穗頸長的遺傳多樣性指數最高，而營養性狀中葉長的遺傳多樣性指數最高。

表2 結縷草屬植物表型性狀遺傳變異分析Table 2 Genetic variation analysis of phenotypic traits of Zoysia

2.2 結縷草屬不同種之間遺傳變異分析

按照結縷草屬的不同種類進行遺傳變異分析，結果如表3所示，與其他種相比，日本結縷草的草層密度、葉片上下表面茸毛密度的變異系數最大，但花序密度、每穗小穗數、千粒重、葉長、葉色和地下莖特征的變異系數均最小；中華結縷草的各性狀表現都比較中等；大穗結縷草的花序密度、每穗小穗數、葉色和地下莖節間直徑變異系數最大；然而雜交結縷草大部分性狀的變異系數都比較大。按所有性狀的平均變異系數從大到小的排序為：雜交結縷草(37.15%)>中華結縷草(30.39%)>日本結縷草(29.17%)>大穗結縷草(25.63%)。通過分析結縷草屬不同種的Shannon多樣性指數發現，日本結縷草的平均多樣性指數最高，為3.11；大穗結縷草的多樣性指數最低，為1.04。這結果表明日本結縷草的性狀多樣性最為豐富，最可能從中篩選出性狀優良的育種材料。

2.3 結縷草屬植物表型性狀的主成分分析

通過主成分分析將結縷草屬植物22個表型性狀集中于5個主成分，累計貢獻率為67.32%(表4)，這表明各性狀的貢獻率分散，累積貢獻率增長不明顯，反映出性狀變異的多向性。由表4可知，第1主成分的特征值為6.09，貢獻率為27.67%，其中葉長、葉寬、花序長、花序寬特征向量的絕對值較高，說明第1主成分主要反映葉片和花序特征因子；第2主成分的特征值為3.65，貢獻率為16.60%，其中小穗形態、小穗長特征向量的絕對值較高，所以稱為小穗特征因子；第3主成分的特征值為2.11，貢獻率為9.59%，地下莖節間長度、地下莖節間直徑特征向量的絕對值較高，二者屬于地下莖特征因子；第4主成分的特征值為1.63，貢獻率為7.39%，生殖枝高度、穗頸長特征向量的絕對值較高，二者均為高度特征因子；第5主成分的特征值為1.33，貢獻率為6.06%，葉片上表面茸毛密度、葉片下表面茸毛密度特征向量的絕對值較高，可稱為葉片被毛特征因子。

表3 結縷草屬植物不同種表型性狀遺傳變異分析Table 3 Genetic variation analysis of phenotypic traits among four Zoysia species

表4 結縷草屬植物表型性狀的主成分分析Table 4 Principal component analysis of phenotypic traits of Zoysia

2.4 結縷草屬種質資源聚類分析

聚類分析表明，在歐式距離為3.5處，144份結縷草屬種質資源可分成4個類群(圖1)，其性狀平均值和變異系數見表5。第Ⅰ類群共86份材料，包含42份日本結縷草、29份中華結縷草、11份雜交新品(種)系、3份大穗結縷草和1份自然雜交結縷草。這一類群可細分為A、B兩個亞類群，A亞類群主要表現為花序密度高、每穗小穗數和千粒重較高、草層高且密、地下莖節間長又寬，可用于選育種子繁殖型品種，也可進行營養繁殖用于固土護坡。而B亞類群的主要特點為每穗小穗數高、千粒重最大。第Ⅱ類群共30份材料，大部分是日本結縷草，還有2份中華結縷草，主要特點為每穗小穗數最高、千粒重大、小穗卵形、小穗柄彎曲、葉片長而寬、葉片較粗糙、葉色較綠、草層密度最低，適合選育種子繁殖型品種。第Ⅲ類群共25份材料，包含9份日本結縷草、8份雜交結縷草、5份中華結縷草、2份自然雜交結縷草和1份大穗結縷草。這一類群的多數性狀表現居中，屬于中間類型材料。第Ⅳ類群包含3份材料(Z097，Z164和Z168)，其主要特點為花序密度最高、生殖枝高度最矮、花序短而窄、每穗小穗數和千粒重最小、草層低矮濃密、葉片較光滑、葉色深綠，可作為優良親本選育坪用型品種用于公園和小區等綠化。此外，4個類群的性狀沒有表現出明顯的地域特征。

圖1 供試的144份結縷草屬種質資源的聚類圖Fig.1 Cluster diagram of 144 Zoysia germplasm resources

表5 結縷草屬植物4個類群表型性狀特點Table 5 Phenotypic characters of four Zoysia groups

2.5 優質高產種質資源篩選

根據花序密度、每穗小穗數和千粒重篩選具有種子生產潛力的優異種質，發現Z039，Z052，Z101，Z107，Z117，Z136，Z145，Z156，Z157，Z158，Z159，Z169具有高的花序密度和每穗小穗數以及較高的千粒重。這12份材料的花序密度變異范圍為9.20～16.40個·(30 cm)-2，除Z039外其他材料的花序密度都大于10.00個·(30 cm)-2；其每穗小穗數變異范圍為24.40～51.90個，除Z107外其他材料的每穗小穗數均大于30個；其千粒重變異范圍為0.54～0.96 g，以上3個指標值均在所有材料中位居前列。根據草層高度、草層密度和葉色篩選坪用質量優異種質，發現Z007，Z097，Z143，Z164，Z168和Z0419-8具有草層低矮濃密，葉色深綠等特征，這6份材料的草層高度變異范圍為6.14～6.80 cm，在所有材料中排名前20位；其草層密度變異范圍為134.33～192.33個·(30 cm)-2，在所有材料中排名前10位；其葉色變異范圍為2.00～2.50，葉色表現為綠色或深綠色。

3 討論

種質資源遺傳變異研究是遺傳改良的基礎，是新品種選育的關鍵[21]。結縷草屬植物分布廣泛，由于復雜的環境、長期的地理隔離和自然選擇，使結縷草屬植物表型性狀存在豐富的遺傳變異[22]。表型性狀是基因與環境互作的表現形式，在內部基因遺傳的基礎上反應植物對環境的適應性，是研究植物遺傳變異最有效、最直接的指標[23-24]。研究結縷草屬植物表型多樣性，既可以根據不同性狀的變異幅度了解該物種特有的遺傳特性，還有助于挖掘控制重要性狀的優異基因，培育優良的坪用型和種子高產型新品種[25]。

3.1 結縷草屬植物表型多樣性

本研究通過調查結縷草屬植物144份材料的22個性狀，發現所有性狀的變異系數均大于10%，表明結縷草屬植物的表型性狀遺傳差異大，變異豐富，其中花序密度、穗頸長、草層密度和葉片上表面茸毛密度變異系數最高，因而對這些性狀的遺傳改良空間較大。劉建秀等[26]研究也發現中華結縷草種內形態變異很大，其中形態指數的變異系數最大，高至41.5；其次為草層高度、葉色及葉長，變異系數為22.2～22.6。劉建秀等對結縷草種質資源結實性研究中發現，與種子產量相關的3個主要性狀的變異系數從大到小為花序密度>千粒重>每穗小穗數[27]。本研究也發現了相同的結果，表明花序密度的變異系數最大，最有利于育種者進行遺傳改良。在營養性狀中，所有營養性狀的變異系數都大于10%，其中草層密度的變異系數最大，達到44.83%，這些豐富的性狀變異為選育優質坪用型結縷草提供可能。

本研究還對結縷草屬植物表型性狀的Shannon多樣性指數進行了分析，平均遺傳多樣性指數為3.51，調查的22個性狀中僅4個性狀的多樣性指數小于1，表明結縷草屬植物表型性狀存在豐富的多樣性。綜合比較分析結縷草屬植物的變異系數和多樣性指數，發現相同性狀的變異系數和多樣性指數結果不完全一致，如葉片上表面茸毛密度變異系數為47.41%，與其它性狀相比變異系數較大，但多樣性指數只有0.75，與其它性狀相比多樣性指數較低。鄭軼琦等[28]通過遺傳變異系數和多樣性指數對狗牙根(CynodondactylonL.)遺傳多樣性進行分析，也發現了狗牙根的葉腹面毛與小穗長度這2個性狀的變異系數和多樣性指數表現不完全一致，這可能是因為變異系數反應的是性狀的變異程度[29]，而多樣性指數反應的是性狀多樣性的豐富程度[30]。因此，通過變異系數和多樣性指數從不同的角度分析結縷草屬植物表型性狀的遺傳差異和多樣性，更加全面地解析了結縷草屬植物表型性狀的遺傳變異特性。

3.2 結縷草屬植物種間遺傳變異

日本結縷草、中華結縷草、大穗結縷草、雜交結縷草四個種的表型性狀遺傳變異都很豐富，其中雜交結縷草的平均變異系數最大，種內性狀變異豐富，這與雜交結縷草均為不同種之間的雜交后代有關。中華結縷草的平均變異系數大于日本結縷草，表明中華結縷草種內表型性狀存在更大的變異，李亞等[31]對結縷草及中華結縷草種內的性狀變異進行研究，發現中華結縷草的種內變異較日本結縷草大，尤其在生殖枝高度、小穗密度和花序柄長度等性狀上更加明顯。日本結縷草的平均Shannon多樣性指數最高，表明種內性狀多樣性豐富。其中大穗結縷草變異系數和Shannon多樣性指數都是最低的，可能與其研究材料較少有關。

3.3 結縷草屬植物表型性狀主成分特征

本研究對結縷草屬植物22個性狀進行主成分分析，根據特征值大于1的原則選取5個主成分，累計貢獻率達到67.32%，基本能反映全部指標的絕大部分信息，表明這5個成分是影響結縷草屬植物多樣性的主要因素，可分為葉片和花序特征、小穗特征、地下莖特征、高度特征和葉片被毛特征因子。本研究中前3個主成分的累計貢獻率達到53.87%，這與金洪[32]對結縷草屬植物12個性狀主成分分析的結果存在一定差別，其研究中前3個主成分的累計貢獻率達到84.89%，僅第1成分的貢獻率就達到了59.16%，可能是因為種質群體和性狀指標不相同導致的。主成分分析可以將大量的性狀指標濃縮為少數綜合因子，用少數的變量因子代表所有的變量信息[33]。本研究確定了葉片和花序特征、小穗特征、地下莖特征、高度特征(生殖枝高度和穗頸長)和葉片被毛特征因子，可為結縷草屬育種中合理選配親本及品種評價中快速選擇評價指標提供理論依據。

3.4 結縷草屬種質資源聚類特點

聚類分析能夠體現結縷草屬植物種質材料間的親緣關系，根據性狀聚類特點，育種者可以從不同類群中篩選出具有突出性狀的材料進行雜交育種，選育出優良的新品種[34]。基于本文聚類分析結果，144份材料并沒有完全按照種的劃分進行聚類，如第Ⅰ類群和第Ⅲ類群都分別包含了日本結縷草、中華結縷草、大穗結縷草和雜交結縷草。郭海林等[35]利用兩種分子標記對結縷草屬植物的遺傳多樣性進行研究，也發現結縷草屬植物不同種之間有交叉聚類的現象。出現這種情況可能與結縷草屬植物異花授粉的特性有關，結縷草屬植物雌蕊先熟雄蕊后熟，自花結實率低，長期進化過程中，不同種以及同一種的不同種源間會發生基因漂流現象，不同種之間可進行天然雜交，在表型形態上表現出連續變異的現象。在性狀特征上，第Ⅰ類群中A亞類的花序密度高、每穗小穗數和千粒重較高、草層高，草層密度高且地下莖長而寬，適用于選育營養繁殖率高及固土護坡效果好的品種和種子繁殖型品種。B亞類和第Ⅱ類群花序密度低，但每穗小穗數和千粒重高。第Ⅲ類群大部分性狀表現居中。第Ⅳ類群的3個材料Z097，Z164和Z168，草層低矮濃密，葉片光滑，葉色深綠，可作為用于選育坪用質量優異的草坪草親本。從采樣地來看，本研究中聚為一類的材料來源地相差甚遠，這與黃春瓊[36]和宣繼萍[37]利用分子標記研究結縷草屬植物的聚類分析結果有很大差別，這可能是因為結縷草屬植物的原產地對其表型性狀特性可能有著一定的影響，但影響結縷草屬植物的表型性狀特性的因素有很多，如可能與其對后期種植環境的適應性有一定關系，也可能與育種者的集中管理和廣泛栽培加大結縷草屬植物種群間的基因交流有關[38]。Liu等[39]通過形態和SRAP分子標記技術同時對來自國內外的42份海雀稗(Paspalumvaginatum)進行遺傳多樣性分析，發現分子標記的聚類結果顯示來源于同一個地區的更容易聚到一起，而形態聚類結果顯示聚在一起的材料往往來源地相差甚遠，這與本研究對結縷草的研究結果相一致，進一步說明表型形態易受環境影響，因此，下一步工作還應結合分子標記數據對結縷草屬植物進行遺傳變異綜合分析。

3.5 結縷草屬優質高產優異種質資源的篩選

本研究篩選了12份具有種子生產潛力的材料，分別是Z039，Z052，Z101，Z107，Z117，Z136，Z145，Z156，Z157，Z158，Z159，Z169。這些材料除了Z117為中華結縷草外，其他均為日本結縷草，表明日本結縷草具有相對較高的生產種子的潛力。聚類分析發現這些材料聚到前兩類群中，有2份材料聚類到第I類群的A亞群，7份材料聚類到第Ⅰ類群的B亞群，3份材料聚類于第Ⅱ類群。A亞類的花序密度和每穗小穗數高、千粒重較高，適合篩選具有種子生產潛力的材料。B亞類和第Ⅱ類群的每穗小穗數和千粒重高，花序密度較低，但花序密度所表示的是這一類群的平均情況，聚于這兩類中所篩選的具有種子生產潛力的材料所調查的花序密度都比較高。此外本研究還根據營養性狀篩選出6份草層低矮濃密，葉色深綠，坪用質量高的材料Z007，Z097，Z143，Z164，Z168和Z0419-8，為進一步培育坪用質量高的新品種提供優異的親本材料。

4 結論

本研究從4個方面分析了結縷草屬植物表型多樣性，發現不同表型性狀的變異幅度存在較大的差異，且存在豐富的遺傳多樣性。基于主成分分析，將22個性狀歸為5個主成分。通過聚類分析，將144份材料聚為4個類群。根據花序密度、小穗數和千粒重初步篩選出12份具有種子生產潛力的材料，分別是Z039，Z052，Z101，Z107，Z117，Z136，Z145，Z156，Z157，Z158，Z159，Z169。根據坪用性狀篩選出6份坪用質量高的材料，分別是Z007，Z097，Z143，Z164，Z168和Z0419-8。這18份材料可作為培育種子繁殖型和坪用型新品種的親本材料。本研究僅基于表型性狀分析結縷草屬植物遺傳多樣性，易受環境因素影響，后續研究應綜合分子標記數據，為結縷草屬植物新品種選育和資源改良提供更可靠的理論依據。