circ-PKD2靶向miR-372-3p對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

何 峰，羅少鋒，王 威，趙 磊，王譯文，張 興

結(jié)直腸癌是全球最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率呈明顯上升趨勢[1]。結(jié)直腸癌患者早期癥狀和體征不明顯，確診時多已處于中晚期，導(dǎo)致其預(yù)后較差[2]。結(jié)直腸癌的致病因素復(fù)雜，探討結(jié)直腸癌的發(fā)病機制對臨床預(yù)防和治療具有重要意義。環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)是一種主要存在于細(xì)胞質(zhì)的內(nèi)源性閉環(huán)RNA，不具有編碼蛋白的功能[3]。circRNA可通過多種方式影響癌基因或抑癌基因的表達(dá)，參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[4]。近年，circRNA是結(jié)直腸癌研究領(lǐng)域的熱點。文獻(xiàn)報道circ-PKD2在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中低表達(dá)，與腫瘤細(xì)胞的惡行生物學(xué)行為密切相關(guān)[5]。目前，circ-PKD2在結(jié)直腸癌中的表達(dá)、功能及作用機制鮮有報道。本實驗檢測circ-PKD2在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)水平，著重探討circ-PKD2通過靶向調(diào)控miR-372-3p表達(dá)對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，為circRNA臨床靶向治療結(jié)直腸癌提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2018年9月～2020年11月華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬普愛醫(yī)院/武漢市第四醫(yī)院手術(shù)切除的結(jié)直腸癌及癌旁組織44例。患者術(shù)前均未行化療、放療或免疫治療。44例患者中男性33例，女性11例，年齡(56.13±8.57)歲。TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期26例，Ⅲ+Ⅳ期18例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者23例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者21例。

1.2 細(xì)胞系與主要試劑正常腸黏膜上皮細(xì)胞(HIEC)和結(jié)直腸癌細(xì)胞系(HCT116、HT-29、SW480、LoVo)，均購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫。陰性對照NC質(zhì)粒(pCMV-6空白質(zhì)粒)、circ-PKD2過表達(dá)質(zhì)粒(pCMV-circ-PKD2質(zhì)粒)、miR-NC、miR-372-3p、circ-PKD2野生型重組質(zhì)粒(circ-PKD2-WT)及circ-PKD2突變型重組質(zhì)粒(circ-PKD2-MT)，均購自上海碧云天公司。MTS試劑盒和雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒，購自美國Promega公司。胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基，購自美國Gibco公司。Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑，購自美國Invitrogen公司；qRT-PCR試劑盒購自日本Takara公司；Transwell小室和Matrigel基質(zhì)膠購自美國Corning公司；超敏ECL發(fā)光試劑盒購自美國Thermo Fisher公司。一抗LATS2、CDX2、FOXM1、CTGF、CYR61和辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗，均購自美國BD公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染在37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中，正常結(jié)直腸黏膜上皮細(xì)胞和結(jié)直腸癌細(xì)胞系均采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。取對數(shù)生長期HT-29細(xì)胞分為2個轉(zhuǎn)染組，按照Lipofectamine 3000試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分別轉(zhuǎn)染陰性對照NC質(zhì)粒(NC組)和circ-PKD2過表達(dá)質(zhì)粒(circ-PKD2組)，轉(zhuǎn)染48 h后收集各組HT-29細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.4 qRT-PCR檢測circ-PKD2和miR-372-3p的表達(dá)水平采用Trizol法提取組織和細(xì)胞系的總RNA，檢測RNA純度和濃度后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，應(yīng)用qRT-PCR檢測circ-PKD2和miR-372-3p的表達(dá)水平，circ-PKD2的相對表達(dá)量以GAPDH為內(nèi)參，miR-372-3p的相對表達(dá)量以U6為內(nèi)參，以2-ΔΔCt法計算基因的相對表達(dá)量。引物設(shè)計如下，GAPDH上游引物：5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下游引物：5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′；circ-PKD2上游引物：5′-CATTATTTTCCTAGCGTATGCT CAGT-3′，下游引物：5′-CTGTGACATCATCCGGGTG TAG-3′；U6上游引物：5′-GCTTCGGCACATATACTA AAAT -3′，下游引物：5′-CGCTTCACGAATTTGCGT GTCAT -3′；miR-372-3p上游引物：5′-CGGCGGAG GCAAGATGCTGGCA-3′，下游引物：5′-CAACTGGT GTCGTGGAGTCGG-3′。

1.5 MTS法檢測circ-PKD2對HT-29細(xì)胞增殖的影響取各組HT-29細(xì)胞以3×103個/孔接種于96孔板中，每孔200 μL細(xì)胞懸液，在培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)5天。每天相同時間點，每孔加25 μL MTS試劑(濃度為5 mg/mL)，在培養(yǎng)箱中處理3 h，酶標(biāo)儀檢測各孔在490 nm波長處的吸光度(A490)值，繪制HT-29細(xì)胞生長曲線。

1.6 劃痕愈合實驗檢測HT-29細(xì)胞的遷移能力取各組HT-29細(xì)胞以6×105個/孔接種于6孔板，待HT-29細(xì)胞匯合度為95%，利用10 μL槍頭在6孔板底部垂直劃痕，采用無血清DMEM培養(yǎng)基洗3次，每孔加入2 mL無血清DMEM培養(yǎng)基。于倒置顯微鏡下觀察并測量劃痕寬度，記為W1。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，于倒置顯微鏡下觀察并測量劃痕寬度，記為W2。HT-29細(xì)胞劃痕愈合率=(W1-W2)/ W1×100%。

1.7 Transwell實驗檢測HT-29細(xì)胞的侵襲能力在冰上預(yù)鋪Matrigel基質(zhì)膠至Transwell小室上室，培養(yǎng)箱內(nèi)充分凝固。取各組HT-29細(xì)胞采用無血清DMEM培養(yǎng)基重懸后，以3×104個/孔接種于Transwell小室上室，每孔200 μL細(xì)胞懸液。每孔加入600 μL無血清DMEM培養(yǎng)基至Transwell小室下室。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，采用多聚甲醛固定和結(jié)晶紫染液染色，流水輕輕沖洗，棉簽擦去未穿膜的細(xì)胞，在倒置顯微鏡下拍照并計數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.8 生物信息學(xué)預(yù)測和雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞Ccirc-PKD2的靶基因根據(jù)circRNA生物信息學(xué)網(wǎng)站starBase v2.0(http://starbase.sysu.edu.cn/starbase2/index.php)預(yù)測circ-PKD2的靶基因為miR-372-3p，分析circ-PKD2與miR-372-3p之間的作用序列。將HT-29細(xì)胞接種于24孔板中，circ-PKD2野生型重組質(zhì)粒(circ-PKD2-WT)及circ-PKD2突變型重組質(zhì)粒(circ-PKD2-MT)聯(lián)合miR-NC、miR-372-3p共轉(zhuǎn)染HT-29細(xì)胞，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。采用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒分別檢測螢火蟲熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性，HT-29細(xì)胞的相對熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性。

1.9 Western blot法檢測HT-29細(xì)胞中靶基因表達(dá)水平收集各組HT-29細(xì)胞，使用RIPA裂解液裂解細(xì)胞并提取總蛋白。各組取等量蛋白樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉，分別加入一抗CDX2(稀釋比1 ∶1 000)、FOXM1(稀釋比1 ∶2 000)、CTGF(稀釋比1 ∶2 000)、CYR61(稀釋比1 ∶2 000)和GAPDH(稀釋比1 ∶1 000)孵育過夜，洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(稀釋比1 ∶10 000)孵育2 h，洗膜后采用超敏ECL發(fā)光試劑盒曝光、顯影。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌組織中circ-PKD2的表達(dá)水平結(jié)直腸癌組織和癌旁組織中circ-PKD2的表達(dá)量分別為1.28±0.14和6.38±0.29。與癌旁組織相比，結(jié)直腸癌組織中circ-PKD2的表達(dá)水平明顯降低(P<0.01，圖1)。

圖1 結(jié)直腸癌和癌旁組織中circ-PKD2的表達(dá)水平：與癌旁組織比較，*P<0.01

2.2 結(jié)直腸癌組織中circ-PKD2表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系本組44例以結(jié)直腸癌組織中circ-PKD2表達(dá)水平的均數(shù)1.28為界值，circ-PKD2表達(dá)水平≥1.28為高表達(dá)，<1.28為低表達(dá)。統(tǒng)計學(xué)分析顯示，circ-PKD2表達(dá)與患者年齡、性別無關(guān)(P>0.05)；與結(jié)直腸癌TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.01，表1)。

表1 結(jié)直腸癌組織中circ-PKD2表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 結(jié)直腸癌細(xì)胞系中circ-PKD2的表達(dá)水平正常腸黏膜上皮細(xì)胞(HIEC)和結(jié)直腸癌細(xì)胞系(HCT116、HT-29、SW480、LoVo)中circ-PKD2的表達(dá)量分別為1.00±0.03、0.42±0.05、0.19±0.03、0.82±0.03和0.61±0.08。與HIEC細(xì)胞比較，結(jié)直腸癌細(xì)胞系中circ-PKD2的表達(dá)水平顯著降低(P均<0.01，圖2)，HT-29細(xì)胞中的表達(dá)量最低(P<0.01，圖2)。因此，選擇HT-29細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

圖2 結(jié)直腸癌細(xì)胞和正常腸黏膜上皮細(xì)胞中circ-PKD2的表達(dá)水平：與HIEC細(xì)胞相比，*P<0.01

2.4 各組HT-29細(xì)胞中circ-PKD2的表達(dá)NC組和circ-PKD2組HT-29細(xì)胞中circ-PKD2的表達(dá)量分別為1.02±0.11和12.02±1.08，circ-PKD2組中circ-PKD2的表達(dá)是NC組的11.78倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，提示轉(zhuǎn)染成功。

2.5 circ-PKD2對HT-29細(xì)胞增殖能力的影響與NC組相比，circ-PKD2組HT-29細(xì)胞在第2、3、4、5天的吸光度值降低(P均<0.05)，提示circ-PKD2可抑制結(jié)直腸癌HT-29細(xì)胞增殖。在第1天，兩組細(xì)胞吸光度值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，圖3)。

圖3 circ-PKD2對HT-29細(xì)胞增殖能力的影響：與NC組相比，#P<0.05，*P<0.01

2.6 circ-PKD2對HT-29細(xì)胞遷移能力的影響NC組和circ-PKD2組HT-29細(xì)胞劃痕愈合率分別為(69.65±5.99)%和(25.58±4.33)%。與NC組相比，circ-PKD2組HT-29細(xì)胞劃痕愈合率顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，提示circ-PKD2可抑制結(jié)直腸癌HT-29細(xì)胞的遷移(圖4)。

圖4 劃痕愈合實驗檢測HT-29細(xì)胞的遷移能力

2.7 circ-PKD2對HT-29細(xì)胞侵襲能力的影響Transwell實驗檢測NC組和circ-PKD2組HT-29細(xì)胞侵襲數(shù)分別為(89.28±11.07)個和(41.20±10.33)個。與NC組相比，circ-PKD2組HT-29細(xì)胞侵襲數(shù)降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示circ-PKD2可抑制結(jié)直腸癌HT-29細(xì)胞的侵襲(圖5)。

圖5 Transwell實驗檢測HT-29細(xì)胞的侵襲能力：A.NC組，B.circ-PKD2組

2.8 circ-PKD2與miR-372-3p的靶向關(guān)系starBase v2.0預(yù)測顯示，circ-PKD2的靶基因可能是miR-372-3p，其與circ-PKD2可能的結(jié)合位點及突變位點詳見圖6。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烇@示，與共轉(zhuǎn)染miR-NC和circ-PKD2-WT組相比，共轉(zhuǎn)染miR-372-3p和circ-PKD2-WT組的相對熒光素酶活性顯著下調(diào)(P<0.01)。與共轉(zhuǎn)染miR-NC和circ-PKD2-MT組相比，共轉(zhuǎn)染miR-372-3p和circ-PKD2-MT組的相對熒光素酶活性無明顯變化(P>0.05，圖7)。對結(jié)直腸癌組織中circ-PKD2及靶基因的表達(dá)進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，結(jié)直腸癌組織中circ-PKD2與miR-372-3p的表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)(P<0.01，圖8)。

圖6 circ-PKD2與miR-372-3p基因mRNA 3’UTR互補結(jié)合位點及突變位點

圖7 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞Ccirc-PKD2互補結(jié)合miR-372-3p基因mRNA 3’UTR：與共轉(zhuǎn)染miR-NC和circ-PKD2-WT組相比，*P<0.01

圖8 結(jié)直腸癌組織中circ-PKD2與miR-372-3p表達(dá)的相關(guān)性

2.9 circ-PKD2與miR-372-3p表達(dá)的相關(guān)性NC組和circ-PKD2組HT-29細(xì)胞中miR-372-3p的表達(dá)量分別為1.00±0.05和0.22±0.07，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，提示circ-PKD2可有效抑制miR-372-3p的表達(dá)。NC組和circ-PKD2組HT-29細(xì)胞中大腫瘤抑制因子2(large tumor suppresser homolog 2，LATS2) mRNA的表達(dá)量分別為1.01±0.09和6.55±0.54，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，提示circ-PKD2可上調(diào)LATS2 mRNA的表達(dá)。

2.10 LATS2蛋白和Hippo信號通路蛋白的表達(dá)Western blot法檢測結(jié)果表明，circ-PKD2組HT-29細(xì)胞LATS2蛋白表達(dá)明顯增加，Hippo信號通路蛋白如CDX2、FOXM1、CTGF、CYR61表達(dá)明顯增加(圖9)。

圖9 Western blot法檢測LATS2蛋白和Hippo信號通路蛋白的表達(dá)

3 討論

circRNA通過特殊反向剪接形成的共價閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，不易受核酸酶影響，具有較好的穩(wěn)定性[6]。circRNA在多種人類腫瘤中表達(dá)差異顯著，在不同的腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮不同作用，廣泛參與調(diào)控腫瘤的進(jìn)程[7]。circ-TBL1XR1[8]、circ-UBAP2[9]、circ-CCDC66[10]等circRNA在結(jié)直腸癌中表達(dá)明顯增加，可作為促癌circRNA調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。circ-FNDC3B[11]、circ-SMARCA5[12]、circ-0106714[13]等circRNA在結(jié)直腸癌中表達(dá)明顯降低，可作為抑癌circRNA下調(diào)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。有研究報道，circ-PKD2在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中低表達(dá)，過表達(dá)circ-PKD2可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，下調(diào)circ-PKD2可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[5]。目前，circ-PKD2在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)及其影響尚不明確。本組結(jié)果顯示，circ-PKD2在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)明顯低于癌旁組織，circ-PKD2在結(jié)直腸癌細(xì)胞系表達(dá)明顯低于正常腸黏膜上皮細(xì)胞，circ-PKD2表達(dá)與結(jié)直腸癌TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，circ-PKD2在結(jié)直腸癌細(xì)胞中可能發(fā)揮抑癌作用。

本文以結(jié)直腸癌HT-29細(xì)胞系為分析對象，通過MTS法、劃痕愈合實驗和Transwell實驗發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)circ-PKD2可顯著抑制HT-29細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，circ-PKD2在結(jié)直腸癌中發(fā)揮抑癌作用。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類內(nèi)源性非編碼RNA，通過不完全互補配對結(jié)合靶基因信使RNA(mRNA)，促進(jìn)mRNA的降解或者直接抑制其翻譯，從而負(fù)向調(diào)控靶基因的表達(dá)[14]。circRNA能夠通過競爭性結(jié)合miRNA，抑制miRNA對下游靶基因表達(dá)的干擾作用，上調(diào)miRNA靶基因的表達(dá)[15]。本實驗采用生物信息學(xué)軟件starBase v2.0預(yù)測顯示，circ-PKD2和miR-372-3p能夠互補配對結(jié)合。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染野生型circ-PKD2表達(dá)載體和miR-372-3p后細(xì)胞的相對熒光素酶活性明顯降低。結(jié)直腸癌組織中circ-PKD2和miR-372-3p表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)，證實miR-372-3p是circ-PKD2的靶基因。qRT-PCR檢測結(jié)果進(jìn)一步顯示，circ-PKD2可負(fù)向調(diào)控miR-372-3p的表達(dá)。miR-372-3p在肺鱗狀細(xì)胞癌、乳腺癌等惡性腫瘤中高表達(dá)，可顯著促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移[16-17]。Peng等[14]研究表明，miR-372-3p在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)顯著增加，其表達(dá)水平與腫瘤大小和分化程度密切相關(guān)，miR-372-3p表達(dá)水平較高的患者生存期較短，下調(diào)miR-372-3p表達(dá)可顯著抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。miR-372-3p通過下調(diào)LATS2基因的表達(dá)，阻滯Hippo信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，LATS2是miR-372-3p的靶基因。本實驗通過Western blot法檢測顯示，轉(zhuǎn)染circ-PKD2的HT-29細(xì)胞中LATS2蛋白和Hippo信號通路蛋白如CDX2、FOXM1、CTGF、CYR61蛋白表達(dá)明顯增加，進(jìn)一步提示circ-PKD2主要通過負(fù)調(diào)控miR-372-3p表達(dá)發(fā)揮作用。

綜上所述，circ-PKD2在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞系中低表達(dá)，circ-PKD2通過靶向下調(diào)miR-372-3p表達(dá)，促進(jìn)LATS2蛋白表達(dá)和Hippo信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。circ-PKD2及其靶基因miR-372-3p有望為結(jié)直腸癌的臨床治療提供新的分子靶點。