淀粉樣前體蛋白/早老素1轉基因小鼠腦皮質中過氧化物酶體增殖劑激活受體α的表達及意義

張李娟，趙舒祥，王若溪，卜勇軍，楊 磊，原志慶，李文強，石如玲,

(1.新鄉醫學院公共衛生學院，河南 新鄉 453003；2.新鄉醫學院護理學院，河南 新鄉 453003；3.新鄉醫學院基礎醫學院，河南 新鄉 453003；4.河南省生物精神病學重點實驗室，河南 新鄉 453002)

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是以進行性認知障礙為特征的神經退行性疾病，β-淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)在大腦沉積形成老年斑是AD的主要病理特征之一[1]。過氧化物酶體增殖劑激活受體α(peroxisome proliferators activated receptors α，PPARα)是一種核轉錄因子，參與脂質代謝、能量平衡、氧化應激、炎癥反應及神經遞質釋放等多種生物過程的調控[2-3]。有研究發現，AD患者腦組織內PPARα水平呈低表達，PPARα調控淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)的裂解過程，減少Aβ生成[4-6]。APP/早老素1(presenilin 1，PS1)轉基因小鼠是常見的AD動物模型之一，攜帶人類突變APP Swedish(K595N/M596L)和PS1 deltaE9基因，能較好地模擬AD病理特征和大腦認知功能狀態，如出現Aβ沉積形成的老年斑、學習記憶功能障礙等[7-8]。但目前針對APP/PS1轉基因小鼠體內PPARα表達及相關代謝特征的研究較少?；诖?，本研究以5月齡APP/PS1轉基因小鼠和野生型小鼠為研究對象，觀察其行為學、腦組織形態學及PPARα表達和相關生物化學代謝指標的變化，探討PPARα在AD發病機制中的作用，以期為APP/PS1轉基因小鼠作為AD模型提供更多分子水平依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物5月齡雄性APP/PS1雙轉基因C57BL/6J-TgN(APP/PS1)ZLFILAS小鼠(實驗組)及同遺傳背景同月齡雄性C57BL/6J野生型小鼠(對照組)各10只，體質量21～24 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司[SCXX(京)2014-0004]。飼養環境溫度(23±2)℃，濕度50%～60%，晝夜12 h/12 h，自由攝食飲水，適應飼養1周后進行實驗。

1.2 主要試劑與儀器總膽固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglyceride，TG)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所，Aβ抗體購自美國CST公司，APP抗體購自美國Sigma公司，PPARα、肉堿脂酰轉移酶1(carnitine acyltransferase 1，CPT1)及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體購自美國Santa Cruz公司，脂酰輔酶A氧化酶1(acyl CoA oxidase 1，ACOX1)抗體購自英國Abcam公司，β-actin抗體購自上海齊合生物技術有限公司，山羊抗兔及山羊抗小鼠過氧化物酶標記二抗購自杭州賢至生物科技有限公司，二氨基聯苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色試劑盒購自丹麥DAKO公司；EthoVision XT 8型Morris水迷宮跟蹤成像系統購自德國Noldus公司，電泳及轉膜系統購自美國Bio-Rad公司，Amersham Imager 600化學發光成像系統購自美國GE公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物處理及取材2組小鼠適應飼養后，應用Morris水迷宮測定小鼠空間學習記憶能力。Morris 水迷宮實驗后，2組小鼠分別取3只，禁食12 h，質量分數1%戊巴比妥鈉(40 mg·kg-1)腹腔注射麻醉，40 g·L-1多聚甲醛全身灌流固定，斷頭取腦，用于腦組織中Aβ免疫組織化學染色。其余7只小鼠取股動脈血1 mL，3 000 r·min-1離心10 min，分離血清，置于-20 ℃冰箱保存，用于血清TC、TG測定；然后斷頭處死小鼠，分離大腦皮質、肝組織，置于液氮中，于-80 ℃冰箱中保存備用。

1.3.2 Morris水迷宮實驗測試2組小鼠空間學習記憶能力2組小鼠于適應飼養后行Morris水迷宮實驗，持續 5 d，包括定位航行和空間探索2個階段。定位航行實驗：水下平臺置于第3象限(目標象限)固定位置不變，每只小鼠分別從4個象限中央作為入水點，將小鼠面向池壁放入水中，當小鼠爬上平臺并在平臺上逗留5 s，記錄小鼠找到平臺所需的時間，即為逃避潛伏期，每天訓練4次，每次間隔20 min，持續4 d?？臻g探索實驗：第5天進行空間探索實驗，移除平臺，將小鼠從第1象限放入水中，記錄90 s內小鼠在目標象限游動的時間。

1.3.3 免疫組織化學染色法檢測2組小鼠腦組織中Aβ沉積將多聚甲醛固定的腦組織進行常規脫水、石蠟包埋，連續切片(厚度4.0 μm)，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，用檸檬酸緩沖液(pH 6.0)進行抗原修復；滴加Aβ一抗(滴度1500)，4 ℃孵育過夜；滴加辣根過氧化物酶標記二抗(滴度11 000)，室溫孵育50 min；DAB顯色，Aβ陽性呈棕褐色。顯微鏡下觀察并用Case Viewer軟件掃描染色情況，觀察腦皮質和海馬組織中Aβ陽性斑塊。

1.3.4 Western blot法檢測2組小鼠腦皮質、肝組織中PPARα、APP、ACOX1及CPT1蛋白表達取 30 mg 腦皮質或肝組織，加入300 μL裂解液裂解組織，冰浴勻漿，4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min，取上清液，測定蛋白濃度。用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質，取20 μg蛋白，4 ℃條件下轉膜，將膜置于質量分數5%脫脂奶粉中封閉后，分別加入PPARα一抗(滴度1500)、APP一抗(滴度11 000)、ACOX1一抗(滴度1500)、CPT1一抗(滴度1500)，4 ℃緩慢搖動孵育14 h；然后滴加辣根過氧化物酶標記二抗(滴度14 000)，室溫孵育2 h。將電化學發光液均勻加在膜的正面，應用Amersham Imager 600成像分析儀采集圖像，Image J軟件測定目的蛋白與內參蛋白的灰度值，以目的蛋白與內參蛋白灰度比值表示目的蛋白的相對表達量。

1.3.5 2組小鼠血清中TG、TC水平測定采用甘油磷酸氧化酶法測定2組小鼠血清TG水平，膽固醇氧化酶法測定血清TC水平，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

2 結果

2.1 2組小鼠空間學習記憶能力比較結果見表1。2組小鼠逃避潛伏期隨訓練時間增加均逐漸縮短；實驗組小鼠不同時間點逃避潛伏期短于對照組，但2組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。實驗組小鼠在目標象限游動時間短于對照組，但2組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。

表1 2組小鼠的逃避潛伏期和在目標象限游動時間比較

2.2 2組小鼠腦組織中Aβ沉積情況比較結果見圖1。對照組小鼠腦組織中未見到Aβ陽性斑塊，實驗組小鼠腦皮質和海馬區有大量大小不等的Aβ陽性斑塊。

A：對照組；B：實驗組。

2.3 2組小鼠腦皮質中PPARα、APP蛋白相對表達量比較結果見圖2和表2。實驗組小鼠腦皮質中PPARα蛋白相對表達量顯著低于對照組，APP蛋白相對表達量顯著高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖2 2組小鼠腦皮質中PPARα、APP蛋白表達

表2 2組小鼠腦皮質中PPARα、APP蛋白相對表達量比較

2.4 2組小鼠肝組織中PPARα、ACOX1、CPT1蛋白相對表達量比較結果見圖3和表3。實驗組小鼠肝組織中PPARα、ACOX1、CPT1蛋白相對表達量顯著高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖3 2組小鼠肝組織中PPARα、ACOX1和CPT1蛋白表達

表3 2組小鼠肝組織中PPARα、ACOX1和CPT1蛋白相對表達量比較

2.5 2組小鼠血清中TG、TC水平比較結果見表4。實驗組小鼠血清TG水平顯著高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；實驗組與對照組小鼠血清TC水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。

表4 2組小鼠血清中TG、TC水平比較

3 討論

AD是老年癡呆最常見的類型，是老年人失能和死亡的主要原因，但AD的發病機制并未明晰。研究顯示，AD發病與遺傳因素、脂質代謝、氧化應激、炎癥反應等多種因素有關，這些致病因素可引起Aβ代謝異常，導致Aβ水平過高，進而引起老年斑沉積等病理改變及大腦功能障礙[1]。目前，AD在臨床上尚無有效防治措施，進一步深入探索AD發病機制和潛在的治療靶點對有效預防和治療該病有重要意義。

APP/PS1轉基因小鼠廣泛應用于AD發病機制研究，文獻報道，APP/PS1小鼠3月齡時出現認知行為學變化，5月齡時腦內存在淀粉樣斑塊沉積[9]。本研究結果顯示，5月齡APP/PS1轉基因小鼠腦內淀粉樣斑塊顯著增多，提示5月齡APP/PS1轉基因小鼠可較好地模擬出AD特征性病理變化。此外，本研究中Morris水迷宮實驗結果顯示，實驗組小鼠逃避潛伏期略長于對照組，而且在目標象限游動時間較短，但2組比較差異無統計學意義；這說明5月齡APP/PS1轉基因小鼠空間學習記憶能力僅有輕微降低，認知功能損害較輕微。因此，認為5月齡APP/PS1轉基因組小鼠已經出現特征性病理改變及輕微認知功能損傷。

PPARα屬于配體激活轉錄因子，廣泛表達于全身多種組織。一些配體激活PPARα后可通過降低神經炎癥、增強抗氧化防御、減少Aβ合成、促進Aβ降解等多種機制發揮神經保護作用[2-3,10-11]。研究顯示，AD患者腦內PPARα mRNA水平降低[12-13]。還有研究顯示，PPARα基因敲除小鼠腦組織中Aβ生成增多，且小鼠的認知功能下降[5,14]。因此，推測PPARα有望成為治療AD或其他神經退行性疾病的潛在靶點。另有研究顯示，PPARα表達水平與APP有關，APP是一種跨膜糖蛋白，除作為Aβ前體蛋白經淀粉樣裂解產生Aβ外，APP還具有多種生理功能。在APP基因拷貝數增多的早發性AD患者腦內PPARα表達降低，且PPARα與APP表達水平呈負相關，小鼠或原代培養的神經細胞過表達人源APP基因后也會引起PPARα表達下降[15]，提示APP可能參與了PPARα表達的調控。本研究結果顯示，實驗組小鼠腦皮質中PPARα蛋白相對表達量顯著低于對照組，APP蛋白相對表達量顯著高于對照組，因此，推測APP/PS1轉基因小鼠腦內PPARα表達降低的原因可能與APP基因水平升高有關。有研究顯示，PPARα通過上調α分泌酶表達促進APP非淀粉樣途徑，減少Aβ生成；而PPARα基因敲除小鼠腦內α分泌酶表達減少、Aβ生成增多[5]。因此，推測APP/PS1轉基因小鼠腦組織中Aβ沉積增多的機制除與APP增多有關外，還可能與PPARα表達降低有關。

PPARα在調節脂肪酸分解代謝中具有重要作用，線粒體脂肪酸β-氧化關鍵酶CPT1和過氧化物酶體β-氧化關鍵酶ACOX1均受PPARα調控，PPARα激活后上調CPT1和ACOX1的表達[16-17]。另有研究報道，脂質紊亂、高膽固醇和高TG水平可增加AD發病風險[18-19]。曾檳[20]研究報道，8月齡APP/PS1小鼠血清TG、TC水平顯著升高。本研究結果顯示，與對照組小鼠比較，5月齡APP/PS1轉基因小鼠血清TG水平顯著升高，且其肝臟組織中PPARα及其靶基因CPT1和ACOX1蛋白水平顯著升高。這說明，5月齡APP/PS1轉基因小鼠存在血脂升高、肝臟脂肪酸分解代謝加強等脂質代謝紊亂，但目前尚不清楚APP/PS1轉基因小鼠血清TG水平升高的原因，其肝臟組織中PPARα、ACOX1和 CPT1等表達升高是否與血清TG升高存在內在因果關系尚不能確定。同時本實驗中小鼠肝臟和腦皮質中PPARα表達變化并不一致，其在肝組織中表達增多而在腦皮質中表達卻降低，引起這一差異的機制有待進一步研究。

總之，5月齡APP/PS1轉基因小鼠存在系統性代謝紊亂，但小鼠的空間學習記憶能力降低并不明顯，表明APP/PS1轉基因小鼠的代謝紊亂可能先于行為學損傷；另外，APP/PS1轉基因小鼠腦皮質中PPARα表達降低、肝組織中PPARα及其靶基因CPT1和ACOX1蛋白表達升高，表明PPARα在AD發病機制中具有重要作用；基于此，PPARα及其靶基因有望成為AD早期診斷的潛在靶點。但關于APP/PS1轉基因小鼠肝組織和腦皮質中PPARα表達變化并不一致的原因及代謝紊亂與其基因型之間的內在聯系尚有待進一步研究。