一種利用蝸牛酶轉化重樓皂苷VI制備偏諾皂苷元的方法＊

2022-09-29 15:19:06王亢宗田濟銘張嘉頎薛哲勇

世界科學技術-中醫藥現代化 2022年5期

王亢宗，李敏，田濟銘，張嘉頎，薛哲勇，宋偉，華欣

（東北林業大學生命科學學院哈爾濱 150006）

重樓皂苷（polyphyllin）是重樓植物（Paris polyphylla）中一類重要次生代謝產物，已被報道具有多種良好的藥理活性，包括抗腫瘤，抗氧化，抗炎，抗菌，促凝血，修復胃黏膜等[1-9]。重樓皂苷結構多樣，以薯蕷皂苷型和偏諾皂苷型為主。植物中通過甲羥戊酸途徑合成2,3-氧化鯊烯，由環阿屯醇合酶環氧化形成環阿屯醇，再經過去甲基、還原、異構、羥化等多步反應合成薯蕷皂苷元（diosgenin），薯蕷皂苷元C-17位的氫被羥基取代，形成偏諾皂苷元（pennogenin）[10-11]。而后，在苷元C-3 和C-26 位連接D-葡萄糖、L-鼠李糖和L-阿拉伯糖，進而產生多種重樓皂苷。近年來，含C17α-OH 的甾體天然產物因其有趣的結構和多樣的生物活性而受到廣泛關注，C17α-OH 的存在對它們的生物活性至關重要，因此如何大量獲得含C17α-OH 的甾體的骨架對該類化合物的研究具有重要的意義。

偏諾皂苷元通常與糖基結合形成糖苷，在植物中穩定存在，其自身幾乎不能通過常規酸水解分離提取[12]。同時，對包括七葉一枝花在內的多種重樓屬植物資源的過度開發造成了其資源匱乏[13]。目前已有利用化學方法合成偏諾皂苷元的報道，例如在薯蕷皂苷元引入C17α-OH，但存在反應步驟繁瑣、條件苛刻、產率低、毒副作用等問題。近年，已有一些使用商業酶轉化苷類獲得苷元的研究，具有反應條件溫和、轉化率高、無污染和成本低廉等優點[14-17]。因此，通過商業酶轉化偏諾類皂苷，可能成為大量制備偏諾皂苷元的可行方法。蝸牛酶是從蝸牛的嗉囊和消化道中提取的一種混合酶[9]，目前已明確其含有纖維素酶、果膠酶、淀粉酶、蛋白酶等20多種酶，具有很強的生物轉化能力，能夠特異性切割β-D-吡喃葡萄糖苷鍵。重樓皂苷VI是在偏諾皂苷元C-3位連接二糖，相對較易提取分離，適合作為轉化的原料。本文研究了蝸牛酶轉化重樓皂苷VI獲得偏諾皂苷元的制備條件，確定了影響轉化率的多個因素，通過響應面分析法確定了最佳酶解條件，開發了一種利用蝸牛酶在較短時間內轉化重樓皂苷VI制備偏諾皂苷元的水解方法，且具有較高的產率。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Ultimate 3000 型高效液相色譜儀，包括紫外檢測器（美國Thermo 公司）；恒溫混勻儀MTH-100（杭州米歐儀器有限公司）；真空離心濃縮儀CV200（北京吉艾姆科技有限公司）；萬分之一電子天平SQP（德國Sartorius公司）；超聲波清洗機SB-5200DTD（寧波新芝生物科技股份有限公司）；PB-10 型pH 計（德國Sartorius公司）。

重樓皂苷VI標準品（成都普瑞法科技開發有限公司）；蝸牛酶（BBI生命科學有限公司）；色譜甲醇、乙腈（德國Merck公司）；其余試劑為分析純。

1.2 蝸牛酶轉化重樓皂苷VI反應體系構建

稱取重樓皂苷VI 20.0 mg，與適量蝸牛酶加入20.0 mL 乙酸鈉緩沖液中，適宜溫度下反應一定時間后，加入等量體積的甲醇終止反應，在真空離心濃縮儀中干燥。反應沉淀用色譜甲醇溶解濃縮，0.45 μm濾膜過濾，濾液通過高效液相色譜分離獲得偏諾皂苷元。色譜條件：Hypersil GOLD C18 液相色譜柱（250×10 mm，5 μm）；流動相為高純水（A）和乙腈（B），梯度洗脫（0-2 min，30-40% B；2-6 min，40-80% B；6-7 min，80-100% B；7-13 min，100% B；13-15 min，100-30% B）；流速5.0 mL·min-1，柱溫30°C，檢測波長203 nm，進樣量100 μL。

1.3 偏諾皂苷元轉化率測定

色譜條件：HypersilGOLD C18 液相色譜柱（250×4.6 mm，5 μm）；流動相為高純水（A）和乙腈（B），梯度洗脫（0-3 min，50% B；3-5 min，50-80% B；5-10 min，80-100% B；10-13 min，100% B；13-14 min，100-50%B；14-15 min，50% B）；流速1.0 mL·min-1，柱溫30°C，檢測波長203 nm，進樣量10 μL。轉化率=SHPLC(偏諾皂苷元)/SHPLC(偏諾皂苷元)+SHPLC(重樓皂苷VI)。

1.4 重樓皂苷VI和偏諾皂苷元標準曲線繪制

精密量取重樓皂苷VI 標準品以及分離獲得的偏諾皂苷元，加色譜甲醇分別稀釋成100 μg·mL-1、50 μg·mL-1、25 μg·mL-1、15 μg·mL-1、5 μg·mL-1溶液。以質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，通過線性化獲得重樓皂苷VI與偏諾皂苷元的回歸方程，。

1.5 單因素實驗設計

設置酶用量、反應溫度、反應時間和pH 值四個因素實驗，每個反應中重樓皂苷VI 用量為100 μg，反應體積300 μL。其中，反應時間梯度實驗固定酶用量為0.5 mg，反應溫度37°C，pH = 5.0，反應時間設定為12 h、24 h、36 h、48 h、72 h；酶用量梯度實驗固定反應時間為24 h，反應溫度37°C，pH 5.0，酶用量分別為0.1 mg、0.2 mg、0.5 mg、1.0 mg、2.0 mg；反應溫度梯度實驗固定反應時間為24 h，酶用量為0.5 mg，pH=5.0，反應溫度分別為20°C、28°C、37°C、50°C、60°C；反應pH 梯度實驗設置反應時間為24 h，酶用量為0.5 mg，反應溫度37°C，反應pH分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0。

1.6 正交實驗設計

根據單因素實驗結果，設計三水平四因素的正交實驗（表1）。

1.7 數據處理

以單因素實驗數據作為輸入數據，利用python statsmodels v0.13.1庫進行多項式回歸，遞增degree 值，計算相應的R-squared 值，選擇首個R-squared 極大值對應的模型作為擬合結果；以單因素實驗數據和正交實驗數據作為輸入數據，利用Design Expert 12 軟件進行響應面分析，通過多次擬合下每個因素對應的pvalue值確定模型的最終結果，并求解最優反應條件及轉化率。

2 結果

2.1 偏諾皂苷元的制備與鑒定

經過液相色譜檢測，重樓皂苷VI標準品出峰時間為7 min。蝸牛酶將重樓皂苷VI酶解后，在10.5 min出現了新的產物峰（圖1）。收集足量的產物后，通過核磁分析，與報道的數據比對，確認酶解后的產物為偏諾皂苷元。核磁結果如下，偏諾皂苷元：白色粉末;1H-NMR (500 MHz, CD3OD)δH0.81 (3H, d,J= 6.0 Hz,H-27), 0.85 (3H, s, H-18), 0.90 (3H, d,J= 7.5 Hz, H-21), 1.05 (3H, s, H-19), 3.50 (1H, m, H-3), 4.02 (1H,dd,J= 7.5 Hz, 6.5 Hz, H-16), 5.36 (1H, m, H-6);13CNMR (125MHz, CD3OD)δC38.5 (C-1), 33.2 (C-2), 72.4(C-3), 43.0 (C-4), 142.3 (C-5), 122.2 (C-6), 32.3 (C-7),32.9 (C-8), 51.4 (C-9), 37.8 (C-10), 21.7 (C-11), 32.5(C-12), 45.5 (C-13), 53.9 (C-14), 31.3 (C-15), 90.6 (C-16), 91.3 (C-17), 17.49 (C-18), 19.9 (C-19), 45.8 (C-20), 9.1 (C-21), 110.9 (C-22), 32.1 (C-23), 29.4 (C-24),33.3(C-25),67.7(C-26),17.52(C-27)。

圖1 高效液相分離重樓皂苷VI與蝸牛酶的酶解產物

2.2 偏諾皂苷元轉化率單因素實驗

2.2.1 反應時間對偏諾皂苷元轉化率的影響

控制酶解反應溫度為37°C、酶用量為0.5 mg（每100 μg 底物），反應pH 5.0，轉化率隨反應時間的變化如圖2A 所示?；貧w模型的degree 值設為2，模型Rsquared 值約為0.99，表明回歸模型較好的擬合實驗數據。模型顯示在此條件下，酶解反應時間在12 h到40 h 的區間中，轉化率隨時間變化近似一次函數，此時若繼續增加酶用量或提高酶效率反應會進一步加快；60 h 后反應幾乎達到穩定狀態，此時酶量已經不是制約轉化率的因素。根據此結果，后續正交實驗反應時間設置為24 h、48 h和72 h三個水平。

2.2.2 酶用量對偏諾皂苷元轉化率的影響

控制酶解反應溫度為37°C、反應時間為24 h，反應pH 5.0，轉化率隨酶用量的變化如圖2B所示?；貧w模型的degree 值設為3，模型R-squared 值約為0.99，表明回歸模型較好的擬合實驗數據。模型顯示在此條件下，酶用量在0.1 mg至0.5 mg的區間中，轉化率隨時間變化近似一次函數，此時若繼續增加反應時間或提高酶效率，轉化率會進一步上升；酶用量在1.5 mg左右反應幾乎達到平衡，此時即使增加反應時間轉化率也不會有大的增加。根據此結果，后續正交實驗反應酶用量設置為0.5 mg（每100 μg 底物）、1.0 mg（每100 μg底物）和1.5 mg（每100 μg底物）三個水平。

2.2.3 反應溫度對偏諾皂苷元轉化率的影響

控制酶解反應時間為24 h，酶用量為0.5 mg（每100 μg 底物），反應pH 5.0，轉化率隨反應溫度的變化如圖2C 所示?；貧w模型的degree 值設為4，模型Rsquared 約為0.99，表明回歸模型較好的擬合實驗數據。模型顯示在此條件下轉化率在20°C 到35°C 的區間中上升，在35°C 至40°C 間有最大的轉化率，40°C 后開始下降，并在60°C 附近趨于平穩。根據此結果，可以確定此條件下轉化率峰值出現在30°C 至50°C 之間，據此，后續正交實驗設置反應溫度為28°C、37°C和50°C三個水平。

2.2.4 反應pH值對偏諾皂苷元轉化率影響

控制酶解反應溫度為37°C，反應時間為24 h，酶用量為0.5 mg（每100μg 底物），轉化率隨反應pH 值的變化如圖2D 所示。回歸模型的degree 值設為3，模型R-squared約為0.99，表明回歸模型較好的擬合實驗數據。模型顯示在此條件下，反應pH 值在4.0 至5.0 的區間中，轉化率隨反應pH 快速上升，反應pH 值在6.0至8.0 的區間中轉化率隨pH 值下降。值得一提的是，相較前三個梯度實驗，即使在條件設置完全相同的實驗下，此梯度實驗中的轉化率也有近3倍提升（補充表1-表4），我們通過測定的重樓皂苷VI 和偏諾皂苷元標準曲線計算了各梯度實驗上樣溶液理論初始重樓皂苷VI 含量，在另外3 組實驗中，這個值穩定在4.5-5.5 μg·μL-1，而在pH 梯度實驗中則在6.0-15.0 μg·μL-1波動（補充表1-表4），這可能源于加樣量誤差導致的實驗體系波動，故在之后的模型建立中刪除此部分數據。此結果雖然不能真實的反映pH 值和轉化率的關系，但結合以往的報道，此條件下轉化率的峰值應出現在pH 值為5.0 至6.0 的區間中，依此，設置后續正交實驗反應pH值為4.5、5、6三個水平。

圖2 單因素考察蝸牛酶轉化重樓皂苷VI的轉化率

2.3 偏諾皂苷元轉化率正交實驗與響應面分析

根據單因素實驗的結果，進行四因素三水平的正交實驗，實驗設置與產率見表1。將正交實驗與單因素實驗結果合并（剔除可能因實驗操作帶入誤差的pH梯度實驗），使用Design Expert 12 進行響應面分析，根據每次回歸模型每個因素及其交叉項的置信度（pvalue＜=0.05）迭代模型以確定最終模型。模型擬合概要如表2所示，擬合結果表明，二次方程擬合具有最高的置信度和最大的R-squerd，可以很好的解釋實驗數據。簡化二次模型方差分析如表3 所示，模型和參與模型的每一項因素的p-value 均小于0.05，且lack of fit大于0.1，表明由這些因素構建的模型可以較好的擬合實驗數據，設pH 值為A，酶用量為B，溫度為C，時間為D，轉化率為Y×100%，則模型為Y = -4.42669 +1.35859A + 0.676821B + 0.029450C + 0.013159D -0.003588BD-0.127014A2-0.181855B2-0.000406C2-0.000071D2。該模型表明，酶用量和反應時間對轉化率的影響不是獨立的（圖3），其他條件一定，更少的酶用量則需要更多的時間來達到反應平衡態；反應溫度和pH 對轉化率的影響是獨立的。依此模型，計算使反應轉化率達到最大的最優因素水平約為：反應酶用量1.26 mg（每100μg底物），反應時間60.7 h，反應溫度36.3°C，pH 5.35；預測轉化率約為57%。

圖3 酶用量與反應時間相互作用對偏諾皂苷元產率的影響

表2 模型擬合概要

表3 簡化二次模型方差分析

2.4 模型性能驗證

在實際應用中，往往希望在轉化率和反應時間兩者中尋找一個平衡點，即在較短的時間內獲得較高的轉化率，我們設置了3組反應，即限制反應時間分別在24 h、36 h、48 h 內，計算這3 個條件下的最高轉化率。當反應時間設置在24 h 內，模型最優條件為：反應pH=5.348、酶用量為1.624 mg（每100 μg 底物）、溫度為36.261°C、反應時間為24 h，理論產率為49.5%；為方便實驗操作，我們使用反應pH 為5.35，酶用量為1.6 mg（每100μg底物），反應溫度為37°C進行驗證，求得平均產率為47.0%，與理論產率誤差為5%。當反應時間設為36 h 內，模型最優條件為：反應pH = 5.348，酶用量1.512 mg（每100 μg底物），反應溫度為36.260°C，反應時間為36 h，理論產率為53.4%；為方便實驗操作，我們使用反應pH = 5.35，酶用量為1.5 mg（每100 μg 底物），反應溫度為37°C 進行驗證，求得平均產率為51.5%，與理論產率誤差為3.5%。當反應時間設為48 h 以內，模型最優條件為：反應pH = 5.348，酶用量為1.388 mg（每100 μg底物），反應溫度為36.265°C、反應時間為48 h，理論產率為55.8%；為方便實驗操作，我們使用反應pH = 5.35，酶用量為1.4 mg（每100 μg底物），反應溫度為37°C 進行驗證，求得平均產率為53.8%，與理論產率誤差為3.6%。三次驗證的實際產率和理論產率的誤差都在5%以內，證明了我們模型的準確性。

3 討論

本研究通過高效液相分離和核磁分析，制備并鑒定了偏諾皂苷元。相比天然提取與化學法合成偏諾皂苷元，蝸牛酶水解重樓皂苷VI制備偏諾皂苷元具有廉價，反應條件溫和，轉化率高，位點特異性強，污染率低等優勢，適合實驗室制備，且可能應用于工業化生產。但受限于實驗條件，我們無法進行中試以確定其工業化生產應用的潛力。本研究比較了反應時間、酶用量，反應溫度和反應pH 值對蝸牛酶水解重樓皂苷VI 轉化率的影響，結果表明這4 個因素在一定取值范圍內都與反應效率有較強關聯。其中，隨著反應時間和酶用量的升高，轉化率首先升高，繼而維持在一個穩定的水平；而隨著反應溫度和pH 的升高，轉化率則經歷一個先升后降的過程，表明過高或過低的溫度和pH 會降低蝸牛酶的活性，同時也會影響酶反應本身的平衡態。在4 個因素中，反應時間和酶用量對轉化率的影響是交互的，這是因為時間和酶用量本身并不影響最終反應平衡態，如果將反應達到平衡理解為反應完成，則它們對產率的影響實則是對該條件下時間節點此反應完成到什么程度的影響，而時間和酶用量的變化本質上是在這個樣本空間下有多少底物與酶接觸這一潛在因子。而溫度和pH 則更直接地改變酶本身的性質和反應的平衡態。對于溫度，較高時酶分子內較弱的相互作用，如范德華力、氫鍵等被破壞，酶的高級結構發生改變，進而影響酶催化活性，而水解反應本身是吸熱反應，溫度較低時反應更難發生，同時酶活也下降。對于pH，過堿的pH 不利于糖苷酶從溶劑中獲取質子，過酸的條件不利于糖苷酶釋放質子攻擊糖苷[18]，他們從不同層面影響反應速率的同時還影響反應的平衡狀態，但究竟是一者不會響應另一者改變，還是二者對酶與反應平衡的影響復雜且微妙而難以捕獲尚不明確。此外，目前有研究顯示一些金屬離子可以促進部分β-葡萄糖苷酶的活性[21]，但在蝸牛酶相關的β-葡萄糖苷酶報道中，金屬離子普遍被認為抑制酶的水解活性[15,22]。我們尚未從蝸牛酶中分離出催化重樓皂苷VI水解的純酶，但若能基于明確的酶分子結構，研究酶與金屬離子間分子上的互作與酶活力的關系將有助于提升反應產率，揭示激活抑制作用機制，從而為后續放大實驗以及工業化提供理論指導。

蝸牛酶是一種含有β-葡萄糖苷酶、纖維素酶、果膠酶、淀粉酶、蛋白酶等多種酶的粗糖苷酶。劉欣等從蝸牛酶中分離純化出對人參皂苷Rbl具有較高水解活性的β-葡萄糖苷酶[19]，因此我們推測蝸牛酶中主要起到水解作用的成分是葡萄糖苷酶。目前，有研究表明蝸牛酶能水解蘆?。╮utin）末端的葡萄糖苷鍵，直接生成槲皮素（quercetin），而沒有鼠李糖苷斷裂的中間產物異槲皮苷（isoquercetin）形成[20]。同時，未見蝸牛酶成分中有鼠李糖苷酶的相關報道，在液相色譜檢測時也未發現中間產物偏諾皂苷元-3-O-葡萄糖苷的積累。因此我們認為蝸牛酶不具備水解鼠李糖苷鍵的能力。我們推測，重樓皂苷VI 經過蝸牛酶中的β-葡萄糖苷酶作用，斷裂C-3 位末端的葡萄糖苷鍵，脫掉二糖生成偏諾皂苷元（圖4）。因此。為方便轉化率的計算，我們使用：

圖4 蝸牛酶水解重樓皂苷VI生成偏諾皂苷元

在一定范圍內，重樓皂苷VI和偏諾皂苷元色譜標準曲線是一次的，令S表示峰面積、m表示質量、k表示標準曲線一次項系數、c表示常數項系數，1和2分別表示（終止反應時色譜體系中）重樓皂苷VI 和偏諾皂苷元，則有S1 = k1m1 + c1、S2 = k2m2 + c2。令t 表示體系中初始重樓皂苷質量，m3 表示發生轉化的重樓皂苷VI，Mr表示相對分子質量，則有：

轉化率=，即轉化率是隨體系中轉化的重樓皂苷VI 增加的單調函數。令轉化率為α即α=，則有，對其求導并化簡，得K2tC - K2tc2+k1tc2，其中K2= k2，C=c1+ c2+ k1t，帶入得k2tc1+k1k2t2+ k1tc2；其中，k1，k2表示標準曲線一次項系數，所以k1＞0，k2＞0；t 為體系中初始重樓皂苷VI 質量，即t＞0；c1，c2分別表示標準曲線常數項系數，其實際含義應為測量儀器對重樓皂苷VI和偏諾皂苷元的底噪，理想條件下應當大于等于0，在我們實際實驗測量下，分別為0.0041 和0.0733（見補充表5-表8）；則的導數在我們實驗的條件下恒大于0，即其在轉化率α在區間（0，1）中是單調遞增的，因此是轉化率α 在區間（0，1）上的單調遞增函數，通過來替代轉化率α 以簡化計算是科學的，我們的實驗結果也驗證了這一點。

最后，本研究建立的模型預測轉化率和實際轉化率誤差在5%以內，說明模型對提高蝸牛酶轉化重樓皂苷VI 的效率有指導意義。單因素實驗與正交實驗中重樓皂苷VI 的轉化率最高為48.6%，在模型預測的優化條件下，反應36 h轉化率可以達到51.5%，在節省四分之一時間的同時產率提高了3%。反應優化后的偏諾皂苷元得率高，耗時短，成本低，可能對工業生產有指導作用。