刺五加β-香樹脂醇合酶基因的挖掘及功能驗證＊

李 敏，王亢宗，李艷林，宋 偉，鄭寶江，徐志超，薛哲勇，華 欣

（東北林業大學生命科學學院 哈爾濱 150006）

刺五加（Eleutherococcus senticosus）為五加科五加屬多年生落葉灌木，其根莖發達，莖常密布細刺，掌狀復葉互生，傘形花序，漿果狀核果[1]；多分布于我國東北地區，是我國一種傳統中藥。根據《藥典》記載，以其干燥的根，莖，根莖入藥；其性味辛，苦，溫，有益氣健脾，補腎安神之功效。近年來的研究表明，刺五加具有多種藥理作用，如抗炎[2]，抗氧化[3]，提高免疫能力[4]，抗疲勞[5]以及抗癌等[6]。

刺五加富含多種活性代謝產物，包括三萜皂苷類，多糖類，黃酮類，酚酸類，香豆素，木脂素等小分子化合物，皂苷類化合物是刺五加的主要活性成分之一[7]。近年研究表明，刺五加皂苷具有抑制腫瘤細胞生長遷移[8]，促進神經元樹突擴展活性[9]，影響細胞因子活性[10]，增強細胞增殖能力[11]等多種生理活性，在食品醫藥等方面有良好的前景。然而，20世紀80年代初對刺五加自然資源的過度開采造成了刺五加自然資源的破壞，使刺五加被列為漸危物種[12]；而刺五加皂苷結構較為復雜，在植物體中含量較低，使通過植物體分離提取、化學合成等手段獲取刺五加皂苷相對困難，進而限制其應用。因此通過生物學與生物信息學手段，研究刺五加三萜皂苷生物合成路線，利用合成生物學方法獲得三萜皂苷對解決刺五加皂苷來源問題具有重要意義。

刺五加中具有多種五環三萜皂苷，根據糖苷配基的類型，可以分為齊墩果烷型（oleanane），去甲齊墩果烷型（noroleanane），羽扇豆烷型（lupine）和3,4-半開環羽扇豆烷型（3,4-secolupane）等不同類型，其中齊墩果烷型和去甲齊墩果烷型的變體最多[13]。在植物體中三萜皂苷的前體來源于甲羥戊酸（MVA）途徑和2-C-甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸（MEP）途徑，以同為五加科的人參為例：異戊烯基焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）在香葉基焦磷酸合酶（GPS）的作用下縮合成香葉基焦磷酸（GPP），GPP 在法尼基焦磷酸合酶（FPS）的作用下與IPP 聚合成法尼基焦磷酸（FPP），兩個FPP 經鯊烯合成酶（SS）縮合形成角鯊烯，角鯊烯在鯊烯氧化酶作用下環氧化為2,3-氧化鯊烯[14]。3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A 還原酶（HMGR）是MVA 萜類合成途徑的一個關鍵酶，在刺五加萜類物質的生物合成過程中起到重要的作用。研究發現，當截短的HMGR（tHMGR）基因在植物中過量表達時，萜類次生物質代謝反應產物的含量明顯高于對照植株。因此，在植物中過量表達tHMGR成為生產倍半萜和三萜類物質的普遍適用的方法[15]。氧化鯊烯環化酶（oxidosqualene cyclase,OSC）是一個基因超家族，具有DCTAE 和QW 等保守序列，包含β-香樹素合酶（β-Amyrin Synthase）、達瑪烷二醇合酶（Dammarenediol Synthase）、環阿屯醇合酶（Cycloartenol Synthase）、羽扇豆醇合酶（Lupeol Synthase）、羊毛甾醇合酶（Lanosterol Synthase）等類型[16]。氧化鯊烯環化酶可催化2,3-氧化鯊烯經質子化、環化、重排、去質子化完成環化作用，生成三萜皂苷的前體。其中，齊墩果烷型三萜皂苷的生物合成是由β-香樹素合酶參與完成的，2,3-氧化鯊烯經過β-香樹素合酶作用以“椅-椅-椅”式環化生成β-香樹素；CYP716A與CPR1家族基因發生連續氧化生成齊墩果酸;最后經過細胞色素P450 酶和糖基轉移酶的修飾生成多種多樣的三萜皂苷。目前包括人參、三七、越南人參在內的許多五加科植物中參與三萜皂苷環化和修飾的酶已經被鑒定[17-20]，而刺五加中的三萜環化酶還沒有被鑒定。本研究通過對刺五加基因組中潛在OSC進行系統發育分析，結構預測，表達定量及功能驗證，挖掘了一個刺五加三萜環化酶EsOSC5，為刺五加皂苷生物合成通路的研究提供了重要支持和參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

刺五加種植于東北林業大學試驗田，于2021 年6月采集根、葉、一年生內莖、一年生外莖、二年生內莖等作為實驗材料。本氏煙草（Nicotiana benthamiana）用于基因瞬時表達實驗。

1.2 實驗試劑及儀器

RNA 提取試劑TRIzol Reagent（康為試劑生物公司）、反轉錄試劑盒（TAKARA 生物技術公司）、2×Rapid Taq Master Mix 高保真酶、膠回收試劑盒（OMEGA 公司）、ClonExpress ⅡOne Step Cloning Kit重組酶（Vazyme 生物公司）、質粒提取試劑盒（OMEGA公司）、農桿菌感受態細胞（GV3101）、pEAQ 植物表達載體（實驗室保存菌種）、實時熒光定量試劑盒2*SYBR qPCR Master Mix（悠揚生物科技公司）。

PCR 儀（Eppendorf AG 22331 Hambury），分光光度計（V-1200 SPECTROPHOTOMETER），冷凍干燥機（SCIENTZ-10N，購于寧波新芝生物科技股份有限公司），Roche LC480熒光定量PCR儀。

1.3 刺五加EsOSC5基因的克隆及生物信息學分析

從PFAM 34.0下載OSCNC 端種子序列stockholm格式的比對結果（PF13243, PF13249），用于搜索OSC基因序列。通過HMMER 2.3.2 軟件包的hummbuild腳本（默認參數）對種子序列建立HMM 模型，通過hmmsearch 腳本（默認參數）對預測的刺五加蛋白序列執行搜索，發現潛在OSC序列，并設計引物EsOSC5-F/R（表1）對EsOSC5基因進行克隆。以刺五加根的cDNA 為模板，使用2*Rapid Taq Master Mix 高保真酶進行PCR 擴增，體系為：95℃5 min;95℃15 s,58℃30 s,72℃1 min,32 個循環；72℃5 min；4℃保存。膠回收后與T5 載體連接，轉化大腸桿菌DH5α，篩選陽性克隆測序。使用MEGAX 軟件來構建EsOSC基因的系統進化樹，在NCBI 中查找人參（Panax ginseng），胡蘿卜（Daucus carota）具有不同功能的OSC基因，將刺五加假定EsOSC（EsOSC5）基因與人參，胡蘿卜的已知OSC基因進行Align，Bootstrap 值設為1000，構建系統發育樹。

使用在線軟件SWISS-MODEL (expasy.org)對EsOSC5 進行同源建模，通過AutoDock 對蛋白質EsOSC5 和小分子2,3-氧化鯊烯進行分子對接，使用PyMOL進行可視化。

通過在線軟件ExPASy - ProtParam tool 計算EsOSC5 的各種物理或化學參數，包括分子量、等電點、原子組成、不穩定性指數和疏水性。

使用MEGAX 對刺五加EsOSC5、人參PgOSC、擬南芥AtOSC 蛋白序列進行clustw 多序列比對，MEGAX clustw默認參數，ESPript可視化。

使用kallisto 0.46.2在默認參數下對預測的EsOSC定量，通過prism8.0 分析其組織特異性。通過實時熒光定量PCR 對轉錄組數據進行驗證，設計引物qEsOSC5-F/R，內參基因actin-F/R（表1）。

1.4 刺五加EsOSC5基因表達載體的構建及瞬時表達實驗

采用Gateway 的方法經過BP 反應將刺五加EsOSC5基因連接在pDONR-207 載體上，引物設計為attB-EsOSC5-F/R（表1）。將BP 反應的質粒通過LR反應連入pEAQ 載體，挑取陽性單克隆測序。本實驗將燕麥（Avena sativa）中的HMGR（AstHMGR）基因截短后導入pEAQ 載體，以AstHMGR基因過表達煙草作為對照組，將測序正確的重組質粒pEAQ-EsOSC5、pEAQ-tHMGR分別轉化到農桿菌GV3101 中搖菌培養，待兩者菌液OD600值為0.2 時，6000 rpm 離心5 min集菌。使用Argomix 接種緩沖液（10 mM MgCl2,10 mM MES(pH=5.6),150 μM 乙酰丁香酮）分別對收集到的pEAQ-EsOSC5、pEAQ-tHMGR菌液重懸，將此兩種懸浮菌液暗培養2 h 后注射于生長1 個月的本氏煙草葉片下表皮中，處理組及對照組均設置三個重復。

1.5 刺五加EsOSC5基因瞬時表達煙草代謝產物的測定

本實驗通過菌液懸浮液侵染煙草并收集其代謝產物。pEAQ-EsOSC5、pEAQ-tHMGR菌液侵染煙草5-7 天之后，分別收集注射過的煙草葉片，通過GCQQQ-MS 儀器（Thermo Fisher Trace 1310ISQ，美國）測定次生代謝產物的成分及含量。將收集到的煙草葉片凍干、研磨之后分別稱取10 mg粉末，加皂化劑1 mL（無水乙醇90%，超純水10%，氫氧化鉀10%，以1 mg·mL-1糞醇溶于DMSO作為內標：10 μL·mL-1），75℃皂化1 h后打開管蓋，繼續75℃加熱至乙醇蒸發。向干燥的樣品中加入500 μL 色譜級乙酸乙酯，并渦旋振蕩，其后加入500 μL超純水再次渦旋振蕩。離心1 min使溶液分層（上層液體為黃色，下層液體為綠色）。取50 μL上層液（乙酸乙酯層）移至進樣小瓶襯管中，旋干后重懸于50 μL 衍生化試劑TMA 咪唑（tri-Sil Z）中，70℃加熱30 min，使用GC-QQQ-MS儀器檢測代謝物。

色譜條件：色譜柱為ZB-5 HT（0.25 mm×30 m，Thermo Fisher scientific），載氣為高純氦氣，流速為1.0 mL·min-1，進樣口溫度280℃，進樣量為1 μL，分流比為20:1。程序升溫：起始溫度為170℃，5℃·min-1升溫至290℃，保持4 min，25℃·min-1升溫至340℃。質譜條件：電子能量為70 eV，質量掃描范圍60-800。以β-香樹脂醇（β-amyrin）為標準品，外標法定量。

2 結果

2.1 刺五加EsOSC5基因的克隆及生物信息學分析

測序結果表明，獲得的刺五加EsOSC5（NCBI 登錄號為OM681328）基因CDS 區最大開放閱讀框ORF 全長為2286 bp，編碼761個氨基酸，結果如圖1所示。通過分析得出蛋白質EsOSC5的分子式為C3964H5983N1045O1118S45，分子量為87609.14，原子總數為12155，等電點為6.10，親水性平均系數（GRAVY）-0.356，表明該蛋白具有疏水性，不穩定指數為50.83，表明該蛋白是不穩定的。

圖1 刺五加EsOSC5基因克隆

由MEGAX 軟件構建的刺五加、人參、胡蘿卜的OSC蛋白系統進化樹表明，刺五加EsOSC5蛋白與人參PgBASS2801.2有較高的同源性（圖2），bootstrap 有99.4%的置信度，且二者進化程度相近。故刺五加EsOSC5蛋白可能與人參PgBASS2801.2有相似的功能，均為β-amyrin synthase。

圖2 刺五加EsOSC5與人參，胡蘿卜OSC的系統進化分析

本實驗對EsOSC5，人參OSC及擬南芥OSC進行clustw 多序列比對，結果如圖3 所示。DCTAE 基序在OSCs 中高度保守，是角鯊烯環氧化的起始序列，這個基序中的酸性羧基殘基Asp釋放質子攻擊底物的末端環氧環，從而引發環形成的級聯反應。MWCYCR基序是β- amyrin 合成酶的一個特征基序，其中，Trp 控制齊墩酰陽離子的穩定、Tyr 參與五環三萜的形成。QW基序則參與穩定OSC 的結構。SWISS-MODEL 是歐洲瑞士生物信息中心開發的蛋白質同源建模程序，提供全自動的計算流程，此類同源建模算法首先選定輸入一級序列的同源蛋白結構，然后以同源蛋白的三維結構為模板利用理論計算方法進行優化[21]。本實驗利用SWISS-MODEL 預測EsOSC5的蛋白結構，通過AutoDock 對蛋白質EsOSC5 和小分子2,3-氧化鯊烯進行分子對接（圖4）。

圖3 EsOSC5與人參和擬南芥的β-amyrin synthase的序列比對

圖4 EsOSC5與2,3-氧化鯊烯分子對接

根據刺五加轉錄組數據，對EsOSC5 在不同組織中的表達水平通過prism8.0 進行分析。由圖5 可知，相較于刺五加葉（LEAF），一年生內莖（1N），一年生外莖（1W）以及兩年生內莖（2N），EsOSC5 在刺五加根（ROOT）中表達量明顯提高，且該結果與實時熒光定量PCR 結果一致。因此，我們選取刺五加根的cDNA進行克隆基因，同時為后續代謝組的測定提供參考。

圖5 刺五加中EsOSC5的組織特異性分析

2.2 刺五加EsOSC5基因瞬時表達煙草代謝產物的測定

經農桿菌介導的煙草瞬時表達實驗，分別收集pEAQ-EsOSC5、pEAQ-tHMGR菌液侵染后的煙草葉片，其代謝產物組成及含量通過GC-QQQ-MS 進行測定分析。結果顯示處理組（EsOSC5）的代謝物相比于對照組（tHMGR）產生了新的色譜峰，且與β-香樹脂醇（β-amyrin）標準品的出峰時間一致，進一步對比二級質譜發現兩者為同一種物質，即β-amyrin。由此表明，EsOSC5基因可促進刺五加β-amyrin（三萜皂苷）的合成積累，即β-amyrin 是由EsOSC5基因調控產生，該基因為刺五加β-香樹脂醇合酶基因（圖6）。

圖6 GC/MS總離子流圖譜

3 討論

三萜皂苷是刺五加中一類重要的次生代謝產物，其優良的生理藥理活性使之有可觀的醫用藥用應用前景。但因其結構較復雜，且在植株中含量較低，使其通過傳統的化學提取、合成量產較為困難。解析刺五加三萜皂苷的次生代謝途徑，通過合成生物學的方法實現刺五加三萜皂苷工業化生成的意義不言而喻。三萜合酶在不同植物品系中的自然變異使從不同植物體中發現高效的氧化鯊烯環化酶成為可能，且為三萜生物代謝工程提供了新的活力。本研究挖掘并驗證了一個主要在刺五加根中表達的催化刺五加中2,3-氧化鯊烯“椅-椅-椅”式環化形成刺五加三萜皂苷前體的β-香樹素合酶基因——EsOSC5。Li L A 等研究表明人參β-amyrin synthase 在根中有較高的表達量，與我們的實驗結果相符[22]。相較于親緣關系更遠的擬南芥β-amyrin synthase，EsOSC5和人參β-amyrin synthase 序列更為相似，他們具有一致的DCTAE 保守序列，和幾乎一致的QW（QXXXGXW）保守序列，區別只在于于第三個QW 保守序列發生L-＞P的突變，它們同屬疏水氨基酸，只有側鏈上一個CH2的差異；擬南芥BAS 則與他們有更大的差異，除了每個QW 和DCTAE都具有一個以上的位點發生氨基酸性質變異，還存在氨基酸的增添和缺失。盡管如此，與β-amyrin synthase功能密切相關的473-489基序，特別是纈氨酸是保守的，這個氨基酸的突變會引起OSC 酶功能的改變，例如在擬南芥中V484→A484 可能會引起產物向camelliol C的轉化[23-25]。

植物五環三萜類化合物主要通過甲羥戊酸途徑和戊糖磷酸途徑合成2,3-氧化鯊烯，之后在氧化鯊烯環化酶OSC 的作用下環化成不同的三萜骨架，最后在細胞色素P450（CYP）及糖基轉移酶（UGT）的修飾下形成多種皂苷[26]。目前，本實驗挖掘并鑒定了刺五加β-amyrin synthase 基因EsOSC5，為鑒定刺五加中其他OSC的功能提供了思路，同時為解析刺五加中三萜皂苷類化合物代謝途徑及實現其生物合成奠定了基礎。刺五加中富含多種三萜皂苷。例如：刺五加葉中齊墩果烷型三萜皂苷acanthopanaxosides A、B、C；3,4-開環- 羽扇豆烷型三萜皂苷 Inermoside，1-Deoxychiisanoside， 24-Hydroxychiisanoside， 11-deoxyisochiisanoside；羽 扇 豆 烷 型 三 萜 皂 苷Chiisanoside 和Daucosterol[27-29]。然而，我們對于參與刺五加三萜皂苷生物合成的細胞色素P450 及糖基轉移酶尚不明確。相對于參與三萜皂苷次生代謝的CYP和UGT，OSC有著更為保守的序列及相對較小的家族分歧，這使得挖掘具有功能的OSC相較于CYP、UGT更為容易。而鑒定已知功能的OSC，有助于進一步挖掘參與同一通路的CYP和UGT；一方面，協同行使代謝功能的不同基因，其表達水平可能存在連鎖；另一方面，這些功能基因可能在進化的某一時期聚集，形成生物合成基因簇（BGCs），或者因易位、倍增、丟失等事件而分離，這將在近緣物種的染色體共線性分析中顯示，有助于挖掘相關的功能基因，描述潛在的進化事件。接下來的工作將結合這些內容，繼續挖掘刺五加三萜皂苷生物合成通路中的其他OSC基因及其下游基因CYP和UGT，解析刺五加三萜皂苷代謝途徑并實現其生物合成。