丹參SmCOP1與調控丹參酮和丹酚酸合成相關轉錄因子互作篩選＊

鄧淮鈺，李 倩，郭園藝，張驥驁，郭宏波＊＊，麻鵬達＊＊

（1. 西北農林科技大學化學與藥學院 咸陽 712100；2. 西北農林科技大學生命科學院 咸陽 712100）

丹參（Salvia miltiorrhizaBunge）是唇形科鼠尾草屬的藥用植物，被譽為治療心腦血管類疾病的重要中藥材之一，其干燥根及根莖通常作為藥材被使用，富有諸多有效藥用成分如丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、二氫丹參酮和丹參酮ⅡA 等脂溶性成分，以及丹酚酸A、迷迭香酸以及丹酚酸B 等水溶性成分[1]。但是丹參中有效藥用物質的含量受各種因素影響，不同產地來源的丹參藥用成分含量的差異高達10 倍[2-3]。近年來大多研究集中在提高丹參藥用成分含量和開發利用丹參資源等方面，對代謝過程中關鍵轉錄因子進行調控是重要方法之一，丹參重要藥用活性成分丹參酮和丹酚酸類物質合成通路中關鍵轉錄因子家族包括bHLH 家族[4-5]、MYB 家族、ERF 家族、WRKY 家族以及AREB/ABFs 家族等[6]，一方面可以過表達關鍵轉錄因子促進相應代謝物質的積累，如提高轉錄因子SmMYB36 表達量能有效促進丹參酮積累[7]，過表達SmMYB98 能使丹參酮和丹酚酸的含量升高[8]，另一方面可以對關鍵轉錄因子進行修飾來提高藥用成分含量，但是轉錄因子如何調控丹參酮及酚酸類次生代謝物質合成通路并不完全清楚，泛素化修飾轉錄因子調控丹參活性物質合成的研究也較少。

泛素化修飾是植物細胞中蛋白質翻譯后表達修飾的重要部分，主要通過在一組酶的作用下使得泛素分子靶向修飾底物即靶蛋白從而使其穩定性和亞細胞定位發生變化后改變植物生長發育以及次生代謝過程。其廣泛參與細胞生命體各個活動，如通過參與ABA 信號來促進或抑制植物種子萌發[9]、介導植物冷脅迫相關激素信號通路響應冷脅迫[10]、參與對水分脅迫和干旱脅迫處理的負調節作用如與野生型水稻相比，Ubi：RNAi-OsPUB41敲除突變體和ospub41抑制突變體在蒸騰失水、長期脫水反應中表現出更強的抗旱性[11]?？梢?，泛素化修飾可參與信號傳導從而調控植物生命活動。蛋白泛素化過程主要以三種酶完成，即E1 泛素活化酶、E2 泛素激活酶和E3 泛素連接酶。而E3泛素連接酶在泛素化過程中承擔主要的作用，其負責識別目標蛋白從而使得泛素分子從E2 泛素連接酶上脫離而作用于靶蛋白[12]。E3 泛素連接酶COP1（constitutively photomorphogenic1）具有許多種類，在蛋白質泛素化過程中特異性識別靶蛋白，并通過26S 蛋白酶體系統參與靶蛋白的泛素化[13-14]。其是一個保守的RING 類型E3Ub（ubiquitin）泛素連接酶，通過Ub 蛋白酶體系統介導各種光形態發生促進轉錄因子的降解，而其他COP/DET/FUS 蛋白可能協助這一過程[15-17]。研究發現，COP1 可以介導擬南芥中轉錄因子MYB 和bHLH 對植物萌發生長、光形態建成以及次生代謝等生理過程的調控[18-19]。擬南芥COP1 受光照負調控，其大多與核定位蛋白結合抑制光形態建成[20]。如COP1定位細胞核內靶向結合bHLH 轉錄因子HFR1 并通過26S蛋白酶體途徑進行降解，而光照可促進COP1從細胞核向細胞質轉移而逆轉該作用，從而促進HFR1 的積累[21]。COP1 也可以與光照共同影響擬南芥中的MYB 轉錄因子PAP1 和PAP2 蛋白穩定性[22]。蘋果中E3 泛素連接酶MdCOP1 在黑暗條件下會與MdMYB1互作介導其降解，負調控蘋果花青素生物合成[23]。水稻中具有E3泛素連接酶活性的ZFP181過表達可導致GA 信號途徑中相關基因表達量下降，內源GA 含量降低，同時會導致氨基酸衍生物和吲哚衍生物的合成途徑相關蛋白水平降低，說明E3泛素連接酶會影響植物的激素信號轉導過程以及代謝物合成過程[24]。目前COP1 參與的信號調控網絡在模式植物擬南芥以及其他植物中得到了廣泛研究，但是通過泛素化修飾丹參酮和酚酸等藥用活性成分代謝途徑中關鍵轉錄因子從而調控次生代謝物含量的研究較少。

本研究克隆丹參泛素連接酶SmCOP1 基因，并對其序列及所編碼的蛋白質理化性質進行一定的生物信息學分析，通過與丹參酮和酚酸類物質合成通路中關鍵轉錄因子的互作初步篩選E3 泛素連接酶泛素化修飾的底物，預測丹參E3泛素連接酶通過介導植物激素信號傳導過程參與次生代謝物質的合成，重點說明泛素化在植物次生代謝途徑中所起到的關鍵作用，為采用遺傳轉化策略提高丹參藥用成分含量以及改良丹參品質提供新的思路和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 所需材料

1.1.1 所需植物材料

無菌丹參苗，其種子于商洛基地的天士力公司獲得。

1.1.2 所需試劑與酶

植物基因組RNA 提取試劑盒和普通瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒購自Tiangen Biotechnology(Beijing)公司；工具酶PrimeSTAR? Max DNA Polymerase 和高效cDNA 鏈合成試劑盒購自Takara 公司；pMD18-T 克隆載體購自Takara公司；E.coli DH5α大腸桿菌感受態細胞購自北京康為世紀公司；AH109 酵母感受態細胞購自上海唯地生物技術有限公司；質粒提取試劑盒購自美國OMEGA 公司；Gateway 系統BP 反應酶和LR 反應酶購自美國Invitrogen 公司；引物合成和測序由上海生工、西安奧科和Invitrogen 公司完成。

1.1.3 所需引物

使用Primer Premier 5.0 生物軟件設計，送由TsingkeBiotechnology 公司合成，本實驗所需引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2 丹參cDNA的獲得

先取少許種子用自來水于干凈盆中浸泡12 h，接著流動自來水小水流沖洗12 h；將預處理的種子于超凈臺中滅菌消毒。首先提前準備無菌水、無菌槍頭、0.1% HgCl2、75%乙醇以及0.1%瓊脂水等滅菌材料。將丹參種子先于75%乙醇浸泡1 min，接著無菌水懸浮3-4 次；然后0.1% HgCl2 懸浮浸泡15 min，用無菌水沖洗7 次。注意在懸浮過程中要晃動溶液，保證種子與消毒液以及無菌水充分接觸，避免消毒不徹底；最后用滅菌過的鑷子將種子均勻放置于MS 培養基，結束后將其培養于溫度和光照周期適宜的組培間。選擇三周齡長勢良好的丹參組培苗，取適量完整葉片，使用植物基因組提取RNA試劑盒將其進行液氮研磨提取丹參無菌苗的總RNA。提取結束后通過1%瓊脂糖凝膠電泳看其RNA是否完整無降解，并采用核酸定量儀檢測所提取RNA 濃度和純度。用反轉錄試劑盒將上述RNA 進行反轉錄得到cDNA，并用核酸定量儀檢測所提取cDNA的質量并記錄。

1.3 COP1基因克隆與測序

采用Primer Premier 5.0 軟件設計的引物COP1a-F/R、COP1b-F/R，以上述獲得的cDNA 為模板，采用高保真酶進行目的片段的擴增，PCR 反應程序：98℃，5min；98℃，10 s；56℃，30 s；72℃，1min；34 個循環。PCR 體系為PrimeSTAR Max Premix 使用25 μL 終濃度為1X；分別使用10-15 pmol，終濃度為0.2-0.3 μM 的特異性引物Primer 1和Primer 2，最后使用滅菌蒸餾水將體系補至50 μl。

獲得的PCR 產物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶的存在情況并回收，使用加A 反應試劑盒獲得目的片段，之后再次使用瓊脂糖凝膠電泳和DNA回收試劑盒對獲得的特異性片段進行檢測和回收。采用Takara pMD?18-T Vector Cloning Kit 試劑盒將目的片段連接于pMD18-T。首先取0.1-0.3 pmol 的上述所回收目的片段和1 μL pMD18-T 放置于小型離心管中，ddH2O 補至5 μL，最后將反應液放置于PCR 擴增儀中16℃反應1 h。將全部連接產物轉化DH5α 大腸桿菌感受態，平板上的陽性菌落擴搖后進行菌液PCR，取500 μL 陽性菌液送測。送測結果無誤后進行下一步實驗。

1.4 載體構建

采用OMEGA?質粒小提試劑盒提取實驗室保存的pDONR207 質粒并保存。使用所構建載體pMD18-T-COP1a 作為PCR 反應模板，采用帶有重組接頭的特異性引物attb-COP1a-F/R 進行PCR 反應，結束后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測其有無及位置大小并擴大反應體系將目的片段進行跑膠回收，使用Gateway?BP Clonase?II Enzyme mix試劑盒說明書將目的條帶連接于pDONR207 質粒構建入門載體。使用Gateway?試劑盒，將所構建的入門載體和pDEST-GBKT7 表達載體以3:1反應體系進行LR反應連接。25℃過夜連接并第2天全部連接產物轉化DH5α，挑菌擴搖后進行菌液PCR，將陽性菌液送測并將測序結果無誤的單克隆菌液進行下一步實驗。

1.5 E3連接酶SmCOP1的序列生物信息學分析

首先從NCBI 網站下載擬南芥中的蛋白序列，根據AtCOP1 蛋白序列在本實驗保存的丹參基因組數據庫中利用在線軟件HMMER3程序搜索獲得包含COP1蛋白相對保守結構域的序列，并使用在線程序SMART分析獲得SmCOP1 基因家族序列。利用ExPASy 數據庫中的在線ProtParam 軟件分析丹參SmCOP1 蛋白的氨基酸數、分子量大小、不穩定系數以及等電點等基本相關信息，通過Protscale（https://web.expasy.org/protscale/）在線程序進行親疏水性分析，通過ScanProsi在線軟件預測其所包含的保守結構域，通過Netphos3.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）在線軟件對SmCOP1蛋白序列進行激酶磷酸化修飾位點預測，通過NetOGlyc4.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/）在線軟件進行糖基化修飾位點預測，通過SingalP5.0 在線程序對其所含的信號肽預測，通過TMHMM 在線軟件預測其所含的跨膜結構域，通過Psort Prediction 在線軟件預測蛋白的亞細胞定位，通過MEGA7.0 采用鄰位相連法構建系統進化樹（neighbor-joining, NJ）。通 過 在 線 軟 件SOPMA 和SWISS-MODEL 預測SmCOP1 蛋白的二級結構和三維模型。

1.6 E3 連接酶SmCOP1 調控丹參酮和酚酸類物質機制初探

從現有已知文獻報道中篩選丹參酮和丹酚酸類物質合成通路中關鍵轉錄因子，如bHLH 家族中SmMYC2a[25]、MYB 家 族 中 的SmMYB9b[26]、SmPAP1[27]，ERF 家族中的SmERF1L1[28]和SmERF6[29]、WRKY 家族中的SmWRKY1[30]、AREB/ABFs 家族中的SmAREB1[31]以及促進丹酚酸上調的SmTTG1[32]轉錄因子等，研究其與本研究所克隆的SmCOP1 之間的聯系，以求進一步探索泛素化修飾調控藥用活性物質機制。

將pDEST-GBKT7-COP1a 單轉AH109 酵母感受態，涂布于SD-Trp 獲得單轉化菌株。挑菌落用SDTrp 液體培養基2ml 在10mlEP 管中28℃180 rpm 培養16-18 h，吸取100 μL 將其涂布于SD-Trp/-His/-Ade驗證其是否存在自激活；再與pDEST-GADT7 雜交后在SD/-Trp/-His/-Leu/-Ade 四缺板上進一步驗證其與DNA 激活domain 是否存在直接互作。將pDESTGBKT7-COP1a+pDEST-GADT7 為陰性對照和以pGBKT7-53+pGADT7-T 為陽性對照以及pDESTGBKT7-COP1a 分別與實驗室已構建好的pDESTGADT7-PAP1、 pDEST-GADT7-WRKY1、 pDESTGADT7-MYC2a、 pDEST-GADT7-TTG1、 pDESTGADT7-ERF1L1、pDEST-GADT7-MYB9b、pDESTGADT7-AREB1、pDEST-GADT7-ERF6 等prey 表達載體分別共轉AH109 酵母感受態中，均勻涂在SD/-Trp/-Leu 二缺板上，生長3-4 天后，有菌落生成則證實已獲得雜交菌株，然后分別挑選單克隆，用SD--Trp/-Leu 液體培養基2 mL 在10 mL EP 管中28℃、180 rpm培養16-18 h，統一OD 值為0.5-0.6，分別吸取8 μL 菌液滴在SD/-Trp/-His/-Leu/-Ade 四缺板上，培養3-4天，觀察拍照，做三個生物學重復。

2 結果與分析

2.1 SmCOP1基因克隆與載體構建

克隆到的丹參SmCOP1a和SmCOP1b基因測序結果如圖1所示，克隆序列見附表1，得到了2400 bp左右位置的兩條條帶，與預測的基因序列比對結果于附圖1 和附圖2。結果表明，SmCOP1a與預測結果無差別，而SmCOP1b克隆得到的基因序列與預測序列相比出現1 個堿基的突變。最后得到SmCOP1a的基因長度為2470 bp，SmCOP1b為2412bp，隨后通過Takara pMD?18-T Vector Cloning Kit 試劑盒將SmCOP1a和SmCOP1b基因片段連接于pMD18-T 載體上保存。最后將本實驗所需目的片段SmCOP1a基因通過Gateway方法與酵母表達載體pDEST-GBKT7 連接，獲得pDEST-GBKT7-COP1a重組載體進行下一步實驗。

圖1 SmCOP1基因PCR擴增電泳圖

附圖1 克隆SmCOP1a序列與預測序列比對結果

附圖2 克隆SmCOP1b序列與預測序列比對結果

圖2 SmCOP1蛋白氨基酸親水性/疏水性預測

附表1 SmCOP1克隆序列

附表1 SmCOP1克隆序列

2.2 SmCOP1基因編碼的蛋白質理化性質分析

本研究于丹參全基因組數據庫中篩選到丹參SmCOP1基因，其家族有兩個基因，分別為SmCOP1a和SmCOP1b（SmCOP1基因CDS 序列和所編碼蛋白質序列于附表2 和附表3），之后采用ORF finder 在線軟件分析找到序列的閱讀框，使用ProtParam 在線軟件分析其蛋白的理化性質如分子量、親疏水性等，并且使用Protscale分析得到的親/疏水信號圖如圖2。

附表2 SmCOP1基因組預測CDS序列

附表2 SmCOP1基因組預測CDS序列

附表3 SmCOP1預測基因編碼蛋白序列

SmCOP1a的ORF 長度為2007bp,編碼668 個氨基酸，其分子量74891.47，分子式為C3261H5163N931O1032S33，而SmCOP1b的ORF 長度為2028 bp,編碼675 個氨基酸，其分子量為76075.04，分子式為C3331H5283N937O1041S30。預測結果顯示，SmCOP1 的2 個蛋白均為不穩定蛋白。其中SmCOP1b 蛋白的不穩定系數為55.87，表明SmCOP1b 蛋白與不穩定系數為59.46 的SmCOP1a 蛋白相比來說穩定性更強。親疏水性方面，SmCOP1a 蛋白平均親水性（Grand average of hydropathicity,GRAVY）達到-0.437，而SmCOP1b 蛋白的平均親水性（Grand average of hydropathicity, GRAVY）數值達到-0.443，初步推測兩者都是親水性蛋白。脂溶性方面，SmCOP1b脂溶指數最高，為80.16，而SmCOP1a的脂溶指數為76.06。這一預測結果暗示SmCOP1b 的蛋白熱穩定性可能比SmCOP1a 蛋白高。SmCOP1a 理論等電點6.42＜7,，而SmCOP1b 理論等電點為6.67＜7,兩個都是弱酸性蛋白。從氨基酸組成特點來看，SmCOP 蛋白都包含常見氨基酸，SmCOP1a 中含量最高的為Ser（12.1%），其次為Leu（8.7%）和Ala（7.2%），含量最低的為Trp（1.2%），其負電荷殘基數（Asp+Glu）為88，正電荷殘基數（Arg+Lys）為82。SmCOP1b 蛋白中含量最高的為Ser（11.1%），其次為Leu（9.0%）和Val（7.1%），含量最低的為Trp（1.5%），其負電荷殘基數（Asp+Glu）為85，正電荷殘基數（Arg+Lys）為82。

根據Protscale 分析得到的親/疏水信號圖可知，SmCOP1a 蛋白中間氨基酸部分呈現出概率較高的親水性，如A206 殘基此處表現出親水性達到頂峰（-2.856），而疏水性于A48/A49 此處殘基表現最強（2.122）。而SmCOP1b 蛋白N 端含有親水頭部，中間氨基酸部分呈現出親水性較多，最強親水性位于A151殘基（-3.078），而A167 殘基（2.889）此處疏水性是最強的。從圖中可以看出，兩個SmCOP1 蛋白親/疏水峰值信號大概率都分布于-0.5 以下，從另一方面又可證明SmCOP1兩個蛋白皆是親水性蛋白。

2.3 SmCOP1/SPA蛋白的結構域預測分析

采用ScanProsi 在線分析工具預測其所包含的保守結構域，如圖3 結果表明SmCOP1 蛋白均具有一個WD40結構域，只不過兩者之間長度不一樣，這可能是兩者在進化上有差異的原因之一。SmCOP1a 與SmCOP1b 蛋白均具有典型的COP1 類蛋白結構特征，N-端存在E3 泛素連接酶的保守結構域即環形鋅指結構域（RING-finger），而C-端存在COP1 蛋白與其底物結合的關鍵位置[33]即WD40重復結構域。

圖3 SmCOP1蛋白保守結構域分布

2.4 SmCOP1蛋白的系統進化樹構建

采用生物分析軟件MEGA7.0構建丹參SmCOP1a/b蛋白與玉米ZmCOP1（Zea mays:AQK56296.1）、擬南芥AtCOP1（NP_180854.1）、樹 棉GaCOP1L（Gossypium arboreum: KHG27191.1）、水 稻OsCOP1（Oryza sativa Japonica Group: XP_015627602.1）、番 茄SlCOP1L（Solanum lycopersicum: XP_004250243.1）、蘋 果MdCOP1-1、 MdCOP1-2（Malus domestica:BAM08276.1、XP_028943470.1） 、辣 椒 CaCOP1（Capsicum annuum: KAF3621537.1）、油 菜BnCOP1（Brassica napus: ADL59932.1）等蛋白的NJ 進化樹（圖4）。構建系統進化樹過程中使用RBH 法結果表明SmCOP1a和SmCOP1b是旁系同源基因的關系，而SmCOP1b是AtCOP1的直系同源基因。

圖4 SmCOP1蛋白的系統進化分析

2.5 SmCOP1基因所編碼蛋白質的修飾位點預測

采用NetPhos3.1 進行磷酸化位點分析，預測結果表明如圖5，在系統預設的閾值內SmCOP1a 蛋白預測到9 個酪氨酸（tyrosine）磷酸化位點，17 個蘇氨酸（threonine）磷酸化位點以及56 個絲氨酸（serine）磷酸化位點。而SmCOP1b 蛋白預測有10 個酪氨酸（tyrosine）磷酸化位點，22 個蘇氨酸（threonine）磷酸化位點以及51個絲氨酸（serine）磷酸化位點。

圖5 SmCOP1蛋白的磷酸化位點分析

通過NetOGlyc4.0 在線軟件對蛋白質的糖基化位點進行分析，結果表明SmCOP1a 蛋白具有14 個可能的糖基化修飾位點而SmCOP1b 蛋白具有19 個可能的糖基化修飾位點。

2.6 SmCOP1 基因編碼蛋白質的信號肽、亞細胞定位及跨膜區預測分析

利用SignalP 5.0 對于SmCOP1 蛋白的信號肽序列進行分析，結果并未發現信號肽和剪切位點，推想SmCOP1 蛋白屬于非分泌型蛋白，即SmCOP1 蛋白可能不存在轉運過程，直接在細胞質基質中發揮功能。

利用TMHMM 2.0 預測了SmCOP1 蛋白的跨膜結構域，結果并未發現跨膜結構域和膜內的氨基酸序列，推測SmCOP1蛋白位于膜外，屬于非膜蛋白。

根據Psort Prediction 預測結果（表2），SmCOP1a蛋白定位于葉綠體基質（Chloroplast stroma），葉綠體類囊體膜（Chloroplast thylakoid membrane），葉綠體類囊體腔（Chloroplast thylakoid spac）和細胞核（nucleus）中。SmCOP1b 蛋白定位于內質網膜（endoplasmic reticulum(membrane)），內質網腔（endoplasmic reticulum lumen），過氧化物酶體（peroxisome）和細胞外中。結合信號肽和跨膜結構域的預測結果，推測SmCOP1a蛋白在游離核糖體上合成蛋白多肽，隨后一部分借助葉綠體轉運肽定位到葉綠體，并進一步穿過葉綠體膜進入基質中，另一部分進入細胞核，推測可能大部分在葉綠體基質和細胞核中發揮功能。而SmCOP1b翻譯合成蛋白后一部分進入內質網，大部分位于膜上的非膜蛋白，推測可能是被其他膜定位蛋白招募過去的，另有少量SmCOP1蛋白定位于過氧化物酶體中。

表2 SmCOP1a蛋白的亞細胞定位分析

2.7 SmCOP1蛋白的二級結構分析

利用在線工具SOPMA 預測SmCOP1 蛋白的二級結構，結果見圖6-圖7。SmCOP1a 蛋白結果顯示含有43.26%的無規則卷曲，31.29%的α 螺旋，延伸鏈占20.36%，β-轉角占5.09%，而SmCOP1b 該蛋白質含有44.89%的無規則卷曲，29.33%的α 螺旋，延伸鏈占21.04%，β-轉角占4.74%。

圖6 COP1a蛋白二級結構預測

圖7 COP1b蛋白二級結構預測

2.8 SmCOP1蛋白的三級結構分析

通過SWISS-MODEL進行SmCOP1 蛋白的三維結構預測，所構建的模型如圖8。結果顯示，SmCOP1a蛋白與SmCOP1b 蛋白建模以5igo.1.A 為模板，與目標蛋白序列的一致性分別為84.38%和83.95%，目標模型質量分別為-1.41 和-2.30，說明SmCOP1a 蛋白和SmCOP1b 蛋白序列與相應模板序列的一致度均超過80%。

圖8 SmCOP1蛋白的三維結構建模

2.9 Y2H 分析SmCOP1 調控丹參酮和酚酸物質機制初探

pDEST-GBKT7-COP1a 單轉化菌株在SD-Trp/-His/-Ade 三缺板上無生長說明其無自激活現象，并且與AD-空載體雜菌雜交菌株在SD/-Trp/-His/-Leu/-Ade 四缺板上無生長說明其不存在與DNA 激活域的直接互作。如圖9，共轉質粒于感受態細胞AH109，2-3 天后觀察發現在酵母缺陷性培養基SD/-Leu/-Trp二缺板上可以正常生長菌斑，顯示質粒成功轉化。在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp 平板上，陰性對照（pDEST-GBKT7-COP1a+pDEST-GADT7）和同時轉化的 pDEST-GBKT7-COP1a 和 pDEST-GADT7-WRKY1、pDEST-GADT7-MYC2a、pDEST-GADT7-TTG1、 pDEST-GADT7-ERF1L1、 pDEST-GADT7-MYB9b、 pDEST-GADT7-AREB1、 pDEST-GADT7-ERF6 均無法正常生長，而pDEST-GBKT7-COP1a 與pDEST-GADT7-PAP1 的雜交菌株酵母卻可以長出清晰的白色菌斑，說明COP1a 可能通過泛素化修飾靶向MYB 轉錄因子PAP1來調控酚酸類物質。由系統進化樹分析SmCOP1a是SmCOP1b的旁系同源基因，則很大可能COP1b也參與MYB轉錄因子PAP1泛素化。

圖9 Y2H分析SmCOP1a與轉錄因子互作

3 總結

泛素化是蛋白質組中中常見的翻譯后修飾方式，植物能夠通過泛素-26S 蛋白酶體途徑降解細胞內的周期較短以及結構異常的蛋白，從而調控自身生長發育以及次生代謝過程來適應環境的變化[34-35]。COP1作為RING 型E3 型泛素連接酶能夠特異性泛素化修飾多數底物，并通過26S 蛋白酶體系統促進底物水解[36]，而目前對于COP1的研究僅集中于擬南芥等模式植物。

COP1 在植物和動物中高度保守，其直系同源物在細胞特性、生化活性和預測的分子結構方面具有高度相似性[37]。本研究預測并克隆丹參E3 泛素連接酶SmCOP1基因，對其編碼的蛋白理化性質等進行了一定的生物信息學分析。結果顯示SmCOP1蛋白理化性質不同，使得它們的穩定性存在差異，進而影響其自泛素化過程以及靶蛋白的積累。SmCOP1 具有COP1家族代表性結構特征，N-端具有環形鋅指保守結構域即RING-finger，而C-端的WD40重復結構域則是與靶蛋白結合的關鍵區域。系統進化樹分析SmCOP1a是SmCOP1b的旁系同源基因，SmCOP1a和SmCOP1b基因編碼蛋白質的信號肽和跨膜區預測結果顯示皆為非分泌性蛋白和非膜蛋白。且在蛋白質三級結構分析中，都以同一模板蛋白建模。亞細胞定位分析結果表明COP1a 主要聚集在細胞核內與核內蛋白結合促進其降解，而COP1b 具有細胞質定位信號通過抑制自身的表達提高靶蛋白的積累。本文研究其與核內轉錄因子的作用模式，故酵母雙雜實驗以COP1a 為代表做下游互作基因初步的篩選。

酵母互作結果表明SmCOP1a 與SmMYC2a、SmMYB9b、 SmERF1L1、 SmERF6、 SmWRKY1、SmAREB1 以及SmTTG1 轉錄因子等，體外不互作，卻與R2R3-MYB 轉錄因子SmPAP1 互作。有研究表明，SmPAP1 激活了兩個關鍵迷迭香酸生物合成途徑基因即SmPAL1（苯丙氨酸解氨酶）和SmC4H（肉桂酸4-羥化酶）的啟動子，并且過表達SmPAP1植物和過表達AtPAP1擬南芥的根能夠大量積累迷迭香酸、丹酚酸B、總酚以及總黃酮等活性物質[38]。除此之外，SmPAP1通過與茉莉酸途徑中主要調控轉錄因子MYC2相互作用激活編碼關鍵酶的基因方式參與酚酸生物合成途徑的調節[27]。說明SmCOP1 可能靶向泛素化修飾SmPAP1 后再與其它轉錄因子互作參與茉莉酸途徑，從而調控酚酸生物合成。從另一個方面看，雖然Y2H實驗顯示其與其他關鍵轉錄因子不互作，但這并不代表SmCOP1a對其沒有影響，可能也需要一個中間體去作為它們之間的橋梁。然而Y2H 實驗結果只是說明其具有互作的可能性，仍還需要LCI和COIP 等方法進一步證實。

4 討論

在植物中，E3泛素連接酶影響多種發育和環境反應以及激素信號通路，在脫落酸（ABA）、生長素、油菜素內酯（BR）、細胞激肽（CK）、乙烯、赤霉酸（GA）、茉莉酸（JA）、水楊酸（SA）和金合子內酯（SL）等植物激素信號通路中發揮核心調控作用[39]。植物激素會影響COP1 選擇性泛素化降解多種轉錄因子來響應不同的信號，進而影響植物的多種生理過程，例如ABA 長期的處理會使得COP1介導GLK1泛素化降解，降低與光合作用相關的基因表達，影響葉綠體的形態[40]；JA 可通過減少細胞核內COP1 蛋白的積累以及減少與SPA蛋白的相互作用來抑制COP1 活性，從而刺激子葉展開[41]。而丹參酮和丹酚酸等藥用活性物質受到激素信號網絡的調控，接下來可將目光聚焦在COP1 泛素化降解關鍵轉錄因子調控活性物質的合成。COP1 蛋白在光形態建成中起到重要的抑制作用[42]，在黑暗條件下COP1通常在細胞核中富集[43]，可針對多種光形態發生促進因子進行泛素化降解[44]，而光照會使得相關轉錄因子積累，促進光形態過程。COP1的保守N端部分可與光信號傳導過程中必不可少的轉錄因子HFR1結合，介導其泛素化降解，而光可消除該降解作用，促進光信號轉導[45]。此外，COP1 對不同物種的HFR1 具有不同的結合親和力，例如AtHFR1與COP1的結合比其他植物COP1 底物弱約100 倍[46]，該結合能力的差異會影響HFR1 的穩定性，進而影響植物的光形態發生乃至于植物其他生命活動過程。由此可以推測COP1 在不同植物中對次生代謝物的調控作用也有可能存在差異。

目前有研究發現COP1 體內外都可以和4 個SPA蛋白在空間上形成復合體，通過物理互作的方式行使功能[47-48]。在體外COP1 活性較高，可自主發揮功能，而在體內需要以復合體形式參與靶蛋白的修飾[49]。盡管對SPA蛋白的初步研究主要集中在其增強COP1 E3連接酶功能中的輔助作用，但發現SPA1的N端結構域具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，可磷酸化靶蛋白促進COP1和SPA 蛋白中的WD40重復結構域與底物結合。因此同源激酶E3 連接酶復合體可選擇性地與其底物相互作用，并以光誘導的方式快速降解[50]。未來需要進一步的實驗來研究其他COP1-SPA 底物是否也被SPA 激酶磷酸化，以及同源激酶E3泛素連接酶模型是否也適用于丹參等植物和動物中的其他E3 連接酶復合物。據報道COP1-SPA可接著與其他復合體發生互作形成復合體形式如CUL4-DDB1COP1-SPA1，之后再發揮作用[47]。如發現CUL4COP1-SPA復合體作為一個激酶E3泛素連接酶復合體，用于快速光誘導降解PIF1 和PIF5[51]。這一現象說明了SmCOP1 可能直接與SPA 互作，也可能先與相關轉錄因子互作，再和SPA 作用形成復合體，進而泛素化靶蛋白。然而有報道曾指出在黑暗中PCH1 和PCHL 也與PIF1 相互作用，可抑制PIF1 的DNA 結合和轉錄激活活性或通過COP1/SPA復合體誘導PIF1的降解來調節PIF1，表明相關調節因子的泛素化降解有多種形式[52-53]。并且泛素化調控影響植物生命活動機制并不是單一的，它可能降解激素信號通路相互拮抗的兩個調節因子，使其中一個生物角色占重要位置從而調節植物生命活動。在植物的整個生命周期中，光環境控制著植物發育的許多方面。CO 是控制擬南芥光周期開花的關鍵轉錄因子，盡管CO 和COL12 都是COP1/SPA 泛素連接酶的降解靶標，但它們對控制降溫時間的作用是拮抗的。COP1/SPA 的主要功能是在黑暗中調節短日生植物中CO 的降解。相反，光對COL12 的穩定作用可能是通過抑制長日照植物白天CO 蛋白活性適應環境[54]。COP1/SPA 復合體對植物生命活動調節方式也可能存在于如丹參植物和其他動物中。將來可以先確定COP1s和SPAs是否存在互作，之后以互作形成的復合體形式深入探索其對丹參藥用活性成分關鍵轉錄因子的泛素化修飾機制，還可以通過多種方式篩查確認是否有其他的E3連接酶在泛素化過程發揮重要作用。如利用Cell free 瞬時體系進一步驗證篩選介導關鍵核心轉錄因子降解的E3泛素連接酶。

總之，本實驗初步篩選到與丹參E3泛素連接酶互作的SmPAP1 蛋白，預測SmCOP1 通過泛素化修飾SmPAP1 促進酚酸等生物活性化合物的積累，并也可能影響SmPAP1 與茉莉酸信號通路中主要調控因子MYC2 的結合，進而調控植物次生代謝物的合成。本研究將有助于闡明上游E3 泛素連接酶對于調控丹參酮和酚酸合成通路中關鍵核心轉錄因子的泛素化修飾對丹參次生代謝調控的共同作用機制，拓寬了E3泛素連接酶在植物生命體中扮演的角色，也為提高丹參藥用成分含量的研究提供了新的研究方向。