丹參酮生物合成相關SmERF108轉錄因子的鑒定及其靶基因分析＊

盧芷梅，關 睿，蘇立蓉，姚 薇，張李兵，陳珍珍，徐 舜，段禮新，季愛加

（廣州中醫藥大學中藥學院國際中醫藥轉化醫學研究所 廣州 510006）

大宗藥材丹參為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhizaBge.的干燥根和根莖[1]。歷代本草對丹參的論述始載于《神農本草經》，雖有參名，但其補血之力不足，而活血之力有余，具調經活血、止痛祛瘀、涼血除煩安神之功。丹參具有保護心臟，改善心臟供血、擴張心臟的冠狀動脈、活血化瘀預防血栓等作用，成為心血管疾病的首選中藥[2-4]。丹參的有效活性成分主要分為2 類：水溶性的酚酸類成分和脂溶性的丹參酮類成分，其中丹參酮類是心腦血管疾病治療的活性成分，主要分布于丹參根及根莖周皮木栓層[5-8]。丹參的生態適應性強，產地分布廣。由于野生資源減少，目前丹參主要以田間栽培為主，但近年來栽培丹參質量嚴重下降，含量較低，大大限制了市場需求[9-10]。加強對丹參次生代謝調控機制的研究，有利于提高丹參的產量和品質。目前關于丹參調控機制研究主要集中于轉錄因子（Transcription factor），轉錄因子在丹參的次生代謝生物合成過程中起著重要作用[11-12]。

轉錄因子通常能夠調控多個生物合成途徑基因，是影響藥用植物次生代謝物質合成和積累的重要調控因子[13-15]。其中AP2/ERF 轉錄因子家族是一類大的植物特異的轉錄因子家族，該基因家族已在丹參中鑒定，包含171 個成員。AP2/ERF 家族分為5 個相對保守的亞家族，包括AP2（25 個基因）、DREB（61 個基因）、ERF(79 個基因)、RAV（4 個基因）和Soloist（1 個基因）[16-17]。AP2/ERF家族的相對保守的5個亞家族均含有AP2/ERF 結構域且作為最主要的特征，AP2/ERF 結構域是由60-70 個氨基酸序列構成的DNA 結合結構域[18-19]。其中ERF 類轉錄因子亞家族屬于AP2/ERF 超家族中最大的一個亞家族，它又可以分為B1-6等6個亞組。丹參作為中國的傳統大宗藥材，國外關于丹參的相關研究較少。目前，ERF 亞家族成員被報道參與激素信號和次生代謝調控，ERF 家族能夠特異性結合GCC-box，在調控花發育、莖尖伸長、次生代謝、生物和非生物脅迫應答中具有重要作用[20-23]，如青蒿（Artemisia annua）中AaERF1和AaERF2兩個轉錄因子可以調控青蒿素的合成；CrERF5 轉錄因子參與調控長春花中長春花堿生物合成[24-25]。

本研究根據前期轉錄組數據篩選到一個新的可能與次生代謝相關的ERF 基因SmERF108[17]，對SmERF108 進行生物信息學和亞細胞定位分析，轉錄激活實驗探究其轉錄激活活性，對途徑酶基因啟動子分析發現SmCPS1啟動子區含有GCC box 位點，預測SmERF108可能結合該位點調控SmCPS1的表達，SmCPS1是丹參酮生物合成途徑上二萜骨架形成的環化酶，并通過酵母單雜交實驗驗證可能調控SmCPS1。初步明確SmERF108基因在丹參中的調控模式，為深入研究丹參SmERF108基因功能奠定基礎，進而深入探討ERF 轉錄因子在丹參次生代謝途徑中的調控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用植物材料丹參（S. miltiorrhizaBge）取自中國醫學科學院藥用植物研究所，經廣州中醫藥大學中藥學院季愛加副研究員鑒定確認。選取生長健壯，處于盛花期的丹參，包于錫箔紙內，立即置于液氮速凍，置于-80℃冰箱備用。擬南芥（Arabidopsis thaliana）種子來源實驗室保存。

1.2 RNA提取和反轉錄

采用液氮研磨，參照快速通用植物RNA 提取試劑盒（華越洋生物科技有限公司，0416-50gk）說明書提取丹參各組織的總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，并用核酸定量儀測定其濃度。參照反轉錄試劑盒（湖南艾科瑞生物工程，AG11615）說明書將RNA反轉錄為cDNA。

1.3 克隆基因SmERF108

根據基因組數據庫中SmERF108基因序列設計特異性引物并進行 PCR 擴增，SmERF108-F：ATGACAACCTCAGACGCATC；SmERF108-R:TTAGCAGTGCATCTCACACAA；隨后對產物進行切膠回收，將回收后的產物連接至PLB 載體，轉化至DH5α感受態細胞，涂布于含氨芐青霉素抗性的LB 固體平板上，37℃恒溫培養箱中，暗培養12-15 h。挑取單一菌落于含氨芐青霉素抗生素的培養液中37℃恒溫搖菌，進行菌液PCR 陽性鑒定，將陽性菌液送生工生物工程上海股份有限公司測序。

1.4 SmERF108生物信息學分析

使用NCBI 中的CD-Search 和PFAM 蛋白家族數據庫確認SmERF108 轉錄因子保守結構域，同時利用MEME在線分析網站預測保守基序；用ComputePI/MW對蛋白質的等電點、分子式等進行計算；通過ExPASy網站中的ProtParam 與ProtScale 分別對蛋白特性與親疏水性進行預測分析；用在線分析網站TMHMMServer,v.2.0 與SignalP-5.0 分別對跨膜域和信號肽進行預測分析；在線分析網站Disulfind 與NetPhos3.1Server 分別對二硫鍵與磷酸化位點進行預測；此外，用SOPMA 網站進行SmERF108 二級結構預測分析，最后利用Swiss-Model 與Phyre2 構建蛋白的三級結構模型。

1.5 順式作用元件預測

將測序驗證的SmERF108序列通過softberry 網站中的HMM-based gene structure prediction 模塊對目的基因的基因結構進行預測，并得到相應的氨基酸序列；使用軟件TBtools 在丹參基因組進行對比，索取并獲得SmERF108上游2000 bp 基因序列，用PlantCARE對上游順式元件進行預測。

1.6 SmERF108系統進化分析

數據庫搜索并提取ERF 亞家族中與次生代謝相關的轉錄因子序列和DREB亞家族中部分功能蛋白序列，包括：來源于青蒿（A. annua）的AaERF1（JN162091.1）、AaERF2（JN162092.1）；來源于長春花（Catharanthus roseus）的CrERF5（MK862158.1）；來源于煙草（Nicotiana tabacum）的 NtERF32（NM_001325036.1）；來源于丹參（S. miltiorrhiza）的SmERF1L1（MH006594.1）、SmERF128（MG897156.1）；來源于菊花（Chrysanthemum morifolium）的CmDREB6（MG199593.1）；來源于水稻（Oryza sativa）的OsDREB2A（Q0JQF7）；來源于擬南芥（A. thaliana）的AtDREB1A（AB007787）、AtDREB2A（AB007790）；來源于馬鈴薯（Solanum tuberosum） 的 StDREB2（JN125858）。利用以上功能蛋白序列與SmERF108構建系統進化樹，采用MEGA-X 軟件，bootstrap 次數1000 次，建樹方法為LG with Freqs.(+F)model，數據方法為Maximum likelihood。

1.7 亞細胞定位

為了分析SmERF108 的亞細胞定位，設計同源臂引物克隆目的基因 ，SmERF108-xbal：gagaacacgggggactctagaATGACAACCTCAGACGCATCG；SmERF108-smal：gcccttgctcaccatcccgggGCAGTGCATC TCACACAATCGG；然 后 將PBI221-GFP 用Xba Ⅰ和SmaⅠ限制性內切酶進行雙酶切，將酶切完全失活的質粒再與帶有同源臂的目的基因進行同源反應。取同源產物轉化至DH5α 大腸桿菌感受態細胞中，涂布于含抗性固體平板上，在37 ℃恒溫培養箱中培養過夜，PCR 鑒定后提取重組PBI221-GFP-SmERF108質粒。同時利用培養4周沒有抽苔的擬南芥葉片制備原生質體。把重組載體導入擬南芥原生質體適宜條件下孵育一段時間，在共聚焦顯微鏡下觀察GFP熒光。

1.8 SmERF108組織差異表達分析

取丹參植株三株，提取不同部位（根、莖、葉、花、周皮、木質部和韌皮部）的RNA，然后反轉錄為cDNA。用于實時熒光定量PCR 的引物為SmERF108-F：TTATGGAGATGAGCTGAACGC；SmERF108-R：AGTGTTCGGGTTCGGGTT；實驗使用QuantStudio5 實時熒光定量PCR 儀，使用TaKaRa 公司的TB Green Premix Ex Taq II，反應體系（10 μL）為：cDNA 模板1 μL，10 μmol·L-1上下游引物各0.4 μL，TB Green Premix Ex Taq II 5 μL，ROX Reference Dye II 0.2 μL，RNase-freeddH2O 3 μL；反應程序為：95℃預變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火34 s，40 個循環，然后收集熒光信號。每個反應進行三個生物學重復，數據根據2-△△Ct法進行分析，用SPSS軟件進行統計分析。

1.9 轉錄激活

通過將pGBKT7 用EcoRI 和SalI 限制性內切酶進行雙酶切，采用同源重組方法，設計帶有同源臂引物，將目的基因克隆到表達載體pGBKT7 上。引物如下，SmERF108EcoRI-F：tatggccatggaggccgaattcATGACAAC CTCAGACGCATCG;SmERF108Sal I-R：atgcggccgctgcaggtcgacTTAGCAGTGCATCTCACACAAT CG。步驟同1.3，將重組載體pGBKT7-SmERF108通過酵母轉化法轉化進釀酒酵母AH109 中，同時轉化空載體pGBKT7 作為陰性對照，轉化pGBKT7-ANAC096作為陽性對照。后續觀察顯色情況判斷有無自激活作用[26]。

1.10 酵母單雜

采用同源重組方法，設計帶有同源臂引物SmERF108-F：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAG GCTNNATGACAACCTCAGACGCATC;SmERF108-R：GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTNTTAGCA GTGCATCTCACACA。基因克隆到表達載體pB42AD上，采用T4 連接方法將ProCPS1克隆到pLacZ-2u 表達載體。將pB42AD用EcoRI、XhoI限制性內切酶進行雙酶切，構建重組載體pB42AD-SmERF108和pLacZ-2u-ProCPS1，然后共轉化釀酒酵母EGY480.4。同時pB42AD 和pLacZ-2u 共轉化釀酒酵母EGY480.4 感受態細胞作為陰性對照，pB42AD-JG 和pLacZ-2u-PZ 共轉化作為陽性對照。通過β-半乳糖苷酶活性測定判斷轉錄因子SmERF108 和關鍵酶基因SmCPS1有無結合作用，是否為其靶基因[27]。

2 結果與分析

2.1 SmERF108基因克隆及測序

提取新鮮的丹參葉片RNA 并反轉錄成cDNA，以此為PCR 擴增模板用引物SmERF108-F/R進行擴增，將擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得大小約為500 bp 的特異條帶（圖1），將該電泳條帶進行切膠回收后測序。測序結果為546 bp 的片段，編碼181個氨基酸。

圖1 PCR產物凝膠電泳圖

2.2 生物信息學分析

2.2.1SmERF108編碼的蛋白性質分析

通過NCBI 中的CD-search 及PFAM 分析發現SmERF108具有AP2保守結構域，屬于AP2/ERF2家族轉錄因子（圖2a）；生物信息學在線分析發現：SmERF108 編碼蛋白由181 個氨基酸殘基組成，蛋白質分子式預測為C876H1368O274S8，相對分子量為2788，等電點為6.31。其中帶負電荷（Asp+Glu）、正電荷（Arg+Lys）的殘基總數分別為28、27。關于編碼的蛋白的親水性與疏水性，推測SmERF108 蛋白為穩定的親水蛋白（圖2b）。通過TMHMM Server, v. 2.0 和SignalP-5.0分析顯示膜內、膜外及跨膜沒有信號變化，推測為非跨膜蛋白（圖2c）。SmERF108含有信號肽的可能性為0.0015，為其他的可能性為0.9985，故SmERF108 推測不含有信號肽，具有轉錄因子的特點。使用NetPhos 3.1 Server 分析磷酸化位點，發現主要為絲氨酸位點共15 個，由此推測SmERF108 蛋白是以絲氨酸為主，蘇氨酸為輔的磷酸化修飾方式發揮調控功能（圖2d）。

圖2 SmERF108 編碼的蛋白性質分析

2.2.2 蛋白質二級、三級結構預測

用SOPMA 對SmERF108編碼的蛋白的氨基酸序列進行二級結構預測，SmERF108 蛋白中含有28.73%α 螺旋、3.31%β 折疊和61.88%無規則彎曲（圖3a）。用Phyre2 與SWISS-MODEL，分別搜索并構建模板，Phyre2 與SWISSMODEL 預測結果顯示均與二級結構預測結果一致（圖3b）。

圖3 SmERF108蛋白質二級結構（a）和三級結構（b）分析

2.3 順式作用元件預測

用PlantCARE 對SmERF108起始密碼子上游2000 bp 啟動子進行調控元件預測（圖4），結果顯示在1000-1400位存在2個defense and stress responsiveness（防御和應激反應元件），0-1800 位有10 個light responsive（光反應元件），在0-1200 位存在2 個lowtemperature responsiveness（低溫反應反應元件），在0-1600 位有2 個auxin responsiveness（生長素響應元件），此外，在0-800 位存在2 個anaerobic induction（厭氧感應元件）。以上結果顯示，SmERF108可能會受到以上環境因子或信號分子誘導，進而促進或抑制SmERF108基因的表達。

圖4 SmERF108啟動子區順式作用元件預測

2.4 SmERF108系統進化分析

用 MEGA X 采 用 Maximum likelihood 對SmERF108和其他功能蛋白進行進化關系分析（圖5），從進化樹結果中可以看出整個系統進化樹聚類為兩大支：ERF 亞家族轉錄因子聚一支，DREB 亞家族成員聚為一支。其中，SmERF108位于第一支，屬于ERF亞家族B3 組成員。進一步對所有蛋白進行保守基序分析發現，所有蛋白序列都包含Motif 1 和Motif 2，屬于保守的AP2/ERF 結構域序列。此外，其他保守基序的分布呈現亞家族特異性，其中ERF 亞家族特異性包含Motif 3、Motif 4、Motif 5、Motif 7 和Motif 9，而Motif 6、Motif 8 和Motif 10 僅存在于DREB 亞家族中。SmERF108 的保守基序分布與丹參的SmERF128 和青蒿的AaERF2 非常接近，推測其與SmERF128 和AaERF2具有相似功能。

圖5 SmERF108蛋白與其他功能蛋白的進化關系及保守基序分析

2.5 亞細胞定位

如圖6，空載體PBI221 的綠色熒光信號充滿整個細胞，而SmERF108 轉錄因子的綠色熒光信號出現在細胞核。說明SmERF108 定位在細胞核，是一個核蛋白，具有轉錄因子基本特征。

圖6 SmERF108轉錄因子亞細胞定位

2.6 SmERF108組織差異表達分析

通過RT-qPCR 檢測SmERF108基因在丹參根、莖、葉片、花、周皮、韌皮部、木質部的差異表達情況（圖7），SmERF108在根皮中表達最高，在葉中也有高表達。丹參酮主要積累于根部，分布規律為周皮（R1）＞韌皮部（R2）＞木質部（R3）[28]，由圖中我們可以看出SmERF108的表達趨勢符合此規律，預測可能與丹參酮的生物合成相關。

圖7 SmERF108組織差異表達分析

2.7 轉錄激活

為了驗證SmERF108 轉錄因子的自激活活性，通過酵母異源表達方法把帶有正確目的序列重組載體pGBKT7-SmERF108轉化進釀酒酵母細胞，表達載體上帶有LacZ 報告基因，通過β-半乳糖苷酶活性測定，結果如圖8，空載體pGBKT7 在顯色板上不顯藍色，陽性對照pGBKT7-ANAC096顯藍色，同時轉錄因子SmERF108 在顯色板上顯藍。說明SmERF108 具有轉錄激活活性。

圖8 SmERF108轉錄因子轉錄激活活性檢測

2.8 SmERF108結合靶基因SmCPS1

為了驗證SmERF108 轉錄因子結合的靶基因，設置陰性對照pLacZ-2u 和pB42AD 轉化釀酒酵母細胞EGY48，陽性對照pB42AD-JG 和pLacZ-2u-PZ 共轉釀酒酵母細胞EGY48（表1）。把構建好的重組載體pB42AD-SmERF108，與構建好的靶基因啟動子重組載體pLacZ-2u-ProCPS1，通過酵母異源表達方法誘導進釀酒酵母細胞EGY48 中，表達載體上帶有LacZ 報告基因，通過β-半乳糖苷酶活性測定。結果如圖9，陰性對照在顯色板上不顯色，實驗組1-2均不顯色，實驗組3，即pB42AD-SmERF108與pLacZ-2u-ProCPS1的共轉顯藍色，并且陽性對照也顯藍色。說明SmERF108與SmCPS1啟 動 子 結 合，SmCPS1作 為SmERF108的靶基因。SmCPS1是丹參酮生物合成途徑上二萜骨架形成的環化酶基因，因此SmERF108 轉錄因子可能通過調控SmCPS1影響丹參酮的合成。

圖9 SmERF108轉錄因子酵母單雜顯色結果

表1 轉化酵母組別

3 討論

進入21 世紀以來，心血管疾病發病率急劇升高，丹參具有保護心臟，改善心臟供血、擴張心臟的冠狀動脈、活血化瘀預防血栓等作用[29-30]，成為心血管疾病的首選中藥。目前，藥材丹參的臨床需求量巨大，但栽培丹參質量下降，含量較低，嚴重影響臨床用藥的安全性和有效性。丹參藥材品質的物質基礎是藥效成分，藥效成分大都屬于植物次生代謝產物，次生代謝生物合成受到環境因子和遺傳因素的影響[31-33]。而轉錄因子不但可以直接或間接調控遺傳基因的表達，還可以通過環境因子介導植物次生代謝合成調控，研究轉錄因子對藥效成分的調控有助于揭示丹參藥材質量形成的分子機制[34]。

AP2/ERF 轉錄因子家族是植物最大轉錄因子家族之一，該家族轉錄因子廣泛參與植物生長發育、脅迫響應和次生代謝等多種生理過程。其中，AP2/ERF轉錄因子被證明能夠調控多個藥物明星分子的生物合成。例如，Yu等發現兩個受到茉莉酸誘導的轉錄因子基因AaERF1和AaERF2，過表達二者后，抗瘧藥物青蒿素生物合成途徑關鍵酶基因ADS和CYP71AV1表達量顯著升高，青蒿酸和青蒿素含量均有所增加[35]。后續研究發現一個腺毛特異性表達AP2/ERF 轉錄因子AaORA 能夠通過正向調控ADS、CYP71AV1、DBR2、AaERF1的表達提高了青蒿素和青蒿酸的產量[36]。其次，在長春花中也發現了包括ORCA3 和CrERF5 在內的多個AP2/ERF 轉錄因子能夠正向調控抗腫瘤藥物長春堿和長春新堿的生物合成[37]。本研究獲得的轉錄因子基因SmERF108在根皮中表達最高，與丹參酮化學成分積累模式一致。此外，根據SmERF108 蛋白與其他功能蛋白的系統發育進化樹結果顯示，SmERF108與青蒿、長春花、煙草和丹參中的ERF亞家族成員聚為一支。其中，SmERF108 轉錄因子與丹參中SmERF128 和青蒿中AaERF2 親緣關系較近且保守基序模式最相似，SmERF128 調控丹參中二萜丹參酮的生物合成[16]，AaERF2調控倍半萜青蒿素的生物合成[35]，據此推測SmERF108 很可能具有調控丹參酮合成的功能。

丹參酮的生源合成來源于二萜骨架途徑，包括甲羥戊酸MVA 途徑及質體磷酸赤蘚糖醇MEP 途徑，其中SmCPS1是丹參酮生物合成途徑上二萜骨架形成的環化酶，與SmKSL1催化前體物質GGPP合成丹參酮前體物質次丹參酮二烯[38]。本研究通過啟動子序列分析發現SmCPS1啟動子區含有GCC box 位點，酵母單雜技術驗證SmERF108能夠結合SmCPS1啟動子區，確定其靶基因可能為SmCPS1，SmERF108轉錄因子可能通過調控SmCPS1影響丹參酮的合成。雖然本研究通過分子互作實驗初步證實SmERF108的功能，但該轉錄因子在丹參體內的功能未知，后續研究需通過轉基因毛狀根或植株體系驗證SmERF108體內的調控功能。此外，可以通過轉基因實驗結果進一步推測SmERF108轉錄因子與丹參酮合成途徑上的其他酶基因是否存在直接或間接的啟動或抑制關系，進一步利用分子互作等技術揭示調控機制，以期全面地闡釋SmERF108轉錄因子的功能。