4種膠體金試紙條檢測牛布魯氏菌病的比較分析

董 浩 ， 李巧玲 ， 孫佳麗 ， 馮 宇 ， 蔣 卉 ， 沈青春 ，許冠龍 ， 朱良全 ， 秦玉明 ， 梁春南

(1.中國食品藥品檢定研究院 ， 北京 大興 102600 ； 2.中國獸醫藥品監察所 ， 北京 大興 102618)

膠體金免疫層析法已被作為一種布魯氏菌病(簡稱“布病”)的初篩方法納入我國衛生行業標準《布魯氏菌病診斷》(WS 269—2019)，但是該方法尚未被收入我國動物布魯氏菌病的診斷標準之中。在實際生產養殖、產地檢疫等情況下，膠體金作為一種快速、敏感的現場檢測方法，具有較高的應用價值。本試驗分別對4種品牌的膠體金試紙條的敏感性、特異性、重復性進行了比較，并使用膠體金試紙條、虎紅平板凝集試驗、試管凝集試驗和競爭酶聯免疫吸附試驗(cELISA)對A19疫苗免疫的牛血清樣品進行了檢測，較全面地對4種品牌的膠體金試紙條的牛血清布病抗體檢測性能進行評估，以期為畜間布魯氏菌病的防控提供一定的技術支持。

1 材料與方法

1.1 血清樣品 114份牛A19疫苗免疫血清采自陜西省某奶牛場，牛群免疫前已經過cELISA檢測，全部為陰性。該牛群免疫前采集的本底血清為本試驗中使用的布病陰性牛血清，用于牛布魯氏菌病標準陽性血清的稀釋，膠體金的特異性和重復性比較。牛布魯氏菌病標準陽性血清由國家/世界動物衛生組織(OIE)動物布魯氏菌病參考實驗室提供。

1.2 試劑 布魯氏菌虎紅平板凝集試驗抗原、布魯氏菌試管凝集試驗抗原和布魯氏菌病cELISA試劑盒，均購自中國獸醫藥品監察所；牛布魯氏桿菌病抗體快速檢測試劑盒，購自廣州悅洋生物技術有限公司；布氏桿菌抗體快速檢測卡，購自深圳市易瑞生物技術股份有限公司；布魯氏菌抗體金標快速檢測卡(競爭法)，購自浙江迪恩生物科技股份有限公司；牛羊布魯氏菌抗體一步法膠體金快速檢測卡，購自上海快靈生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 檢測方法 虎紅平板凝集試驗、試管凝集試驗和cELISA按照《動物布魯氏菌病診斷技術》(GB/T18646—2018)進行。4種膠體金試紙條按照商品說明書的相關要求對牛血清樣品進行檢測。

1.3.2 敏感性比較 使用布病陰性牛血清將牛布魯氏菌病標準陽性血清依次稀釋至40、20、10、5 IU和2.5 IU，分別使用4種膠體金試紙條和布魯氏菌虎紅平板凝集試驗抗原對上述稀釋的牛血清樣品進行檢測，每個稀釋度的血清樣品進行3次重復。

1.3.3 特異性比較 分別使用4種膠體金試紙條對A型口蹄疫疫苗免疫陽性血清、O型口蹄疫疫苗免疫陽性血清、牛沙門菌病疫苗免疫陽性血清和牛巴氏桿菌病疫苗免疫陽性血清進行檢測，并比較它們的特異性。除此之外，還使用27份經過cELISA檢測為布魯氏菌病抗體陰性的牛血清樣品對4種膠體金的特異性進行進一步評價。

1.3.4 重復性比較 分別使用4種膠體金試紙條對3份布病陰性牛血清和3份布病陽性牛血清進行5次重復檢測，比較4種膠體金試紙條的重復性。

1.3.5 臨床樣品檢測 分別使用4種膠體金試紙條、虎紅平板凝集試驗抗原、試管凝集試驗抗原和布魯氏菌病cELISA試劑盒對114份臨床牛血清進行檢測。

2 結果

2.1 不同種膠體金的初步比較 根據4種膠體金的產品說明書，對4種膠體金的檢測原理、樣品需求量、檢測操作和判定時間進行了初步比較，結果如表1所示。

表1 4種膠體金的初步比較Table 1 Preliminary comparison of four colloidal gold strips

2.2 不同種膠體金試紙條敏感性的比較 使用4種膠體金試紙條和虎紅平板凝集抗原分別對效價為40、20、10、5 IU和2.5 IU的牛血清樣品進行檢測，結果顯示：A公司和B公司的膠體金進行3次檢測全為陽性的最低效價均為2.5 IU；C公司和D公司的膠體金進行3次檢測全為陽性的最低效價均為10 IU。4種膠體金試紙條的敏感性均高于虎紅平板凝集試驗。不同效價牛血清的3次檢測結果如表2所示。

表2 4種膠體金試紙條和虎紅平板凝集抗原的敏感性比較Table 2 Sensitivity comparison of four colloidal gold strips and rose bengal plate test

2.3 不同種膠體金試紙條特異性的比較 4種膠體金試紙條對A型口蹄疫疫苗免疫陽性血清、O型口蹄疫疫苗免疫陽性血清、牛沙門菌病疫苗免疫陽性血清、牛巴氏桿菌病疫苗免疫陽性血清樣品均不發生交叉反應。采用4種膠體金試紙條對27份臨床布病陰性牛血清進行檢測，結果也全部為陰性，說明4種膠體金試紙條都具有良好的特異性。

2.4 不同種膠體金試紙條重復性的比較 4種膠體金試紙條在對3份已知布病陽性牛血清的5次檢測中均為陽性，對3份已知布病陰性牛血清的5次檢測中均為陰性。

2.5 不同種膠體金試紙條檢測臨床牛血清效果的比較 檢測結果如表3所示，在4種膠體金試紙條中，A公司膠體金檢出了97份陽性和17份陰性；B公司膠體金檢出了96份陽性和18份陰性樣品；C公司膠體金檢出了99份陽性和15份陰性樣品；D公司膠體金檢出了88份陽性和26份陰性樣品。

根據《動物布魯氏菌病診斷技術》(GB/T18646—2018)，虎紅平板凝集試驗是應用最廣泛的動物布魯氏菌病初篩方法，試管凝集試驗和cELISA可作為動物布魯氏菌病血清學檢測的確診方法，因此本試驗同時采用了虎紅平板凝集試驗、試管凝集試驗和cELISA對上述牛A19疫苗免疫血清樣品進行了檢測，結果顯示，虎紅平板凝集試驗檢測出了85份陽性和29份陰性樣品；試管凝集試驗檢測出了81份陽性和33份陰性樣品；cELISA檢測出了97份陽性和17份陰性樣品。

為了進一步評價4種膠體金試紙條的效果，本試驗分別計算了4種膠體金試紙條與cELISA結果的符合率。結果表明，A公司膠體金與cELISA的符合率為90.35%；B公司膠體金與cELISA的符合率為92.11%；C公司膠體金與cELISA的符合率為87.72%；D公司膠體金與cELISA的符合率為85.09%；虎紅平板凝集試驗與cELISA的符合率為86.84%；試管凝集試驗與cELISA的符合率為84.21%(表4)。

表4 不同檢測方法與cELISA的符合率Table 4 Coincidence rates of different methods with cELISA (%)

3 討論

布魯氏菌病是一種危害嚴重的人獸共患病，也是我國法定檢疫和撲殺被感染家畜的3種重大動物疫病(口蹄疫、布魯氏菌病和結核病)之一[1]。便捷、準確的檢測方法是家畜布病防控的重要技術保障。目前，血清學檢測方法是布病檢測的主要方法，而病原學檢測方法雖然是布病檢測的“金標準”，因為存在操作復雜、實驗周期長、生物安全風險較高、細菌分離率低等問題，應用非常有限。

現行的動物布魯氏菌病檢測國家標準《動物布魯氏菌病診斷技術》(GB/T18646—2018)，布魯氏菌病的血清學檢測方法主要有虎紅平板凝集試驗、試管凝集試驗、乳環試驗、間接ELISA、cELISA和補體結合試驗等。虎紅平板凝集試驗因其操作簡單、成本低廉等原因，廣泛應用于基層獸醫實驗室的布病初篩。但是，虎紅平板凝集試驗作為一種初篩試驗，它的敏感性偏低，該方法最低可以檢測到22.5 IU的布病抗體。

膠體金免疫層析法是近幾年來新興起的一種檢測方法，該方法操作簡單，且在極短的時間內即可讀取結果，十分適合動物疫病的現場檢測。目前，已經有多篇文獻報道了布病診斷用膠體金試紙條的研發[2-5]和布病膠體金試紙條與其他檢測方法的檢測效果比較[6-8]。

奚德華等[9]采用ELISA方法和膠體金方法分別對奶牛布魯氏菌病進行了檢測，其結果表明膠體金方法的敏感性、特異性和準確度均可以滿足布病檢測的需求，而且與ELISA 方法相比，膠體金方法不需要專業的實驗條件，更適用于對奶牛養殖場現場的初篩。董浩等[10]采用膠體金試紙條和虎紅平板凝集試驗對658份牛血清樣品進行檢測時，膠體金試紙條比虎紅平板凝集試驗多檢測出26份陽性樣品。這些數據表明膠體金試紙條比常規的虎紅平板凝集試驗具有更高的敏感性，更利于檢測到動物群體中的弱陽性個體，也更有利于陽性動物的早期診斷和盡早剔除。

和以往比較不同類型布魯氏菌病檢測方法的研究不同，本試驗不僅將膠體金與不同檢測方法之間的效果進行比較，還首次對4種不同品牌的膠體金試紙條檢測牛血清樣品的效果進行了比較，結果表明4種膠體金試紙條的敏感性、特異性和重復性都比較好。值得注意的是，由于本試驗使用的臨床樣品主要是犢牛的A19疫苗免疫血清樣品，而免疫動物的布病抗體滴度往往較低，部分血清樣品的抗體滴度可能會接近膠體金和cELISA的最低檢測限，這就會一定程度上影響膠體金和cELISA之間的符合率。在日常臨床檢測中，進行自然感染或者混合感染布病的牛血清檢測時，理論上膠體金試紙條與cELISA的符合率會更高。可見，膠體金免疫層析法是一種比較可靠的牛布病血清學檢測方法。因此，建議相關部門盡快將膠體金免疫層析法納入動物布病診斷的相關標準中，以提高動物布病的檢測能力，促進家畜布病的防控與凈化。