短鏈合成抗菌肽對犬皮膚致病菌的體外抗菌作用

唐琪宇 ， 楊春燚 ， 王維新 ， 張 迪

(中國農業大學動物醫學院 ， 北京 海淀 100193)

犬小孢子菌和偽中間葡萄球菌是引起犬皮膚感染最主要的病原。隨著抗生素的大量使用，偽中間型葡萄球菌對傳統抗菌藥物的耐藥性增加，促使人們尋求抗生素的替代品[1]。犬小孢子菌感染治療周期長，而抗真菌藥物易引起肝、腎毒性，尋找毒副作用小、殺菌機制獨特的抗菌劑迫在眉睫[2]。抗菌肽(Antimicrobial peptide,AMP)是一類由多個氨基酸殘基組成的具有廣譜抗菌活性的多肽，毒副作用小，不易產生耐藥性，是一種理想的傳統抗菌劑替代品[3]。人工化學合成短鏈AMP，生產成本相對較低，具有大規模生產的可能性以及廣泛的市場應用前景[4]。提取自獨角仙、大鯢和模棘蜈蚣的獨角仙素(Allomyrinasin)、大鯢血素(Andricin B)和模棘蜈蚣素(Pinipesin)，以及2種人工設計的Nigrocin-HLM和Hs02因其優良的抗菌性能而受到關注。本試驗通過研究獨角仙素、大鯢血素、模棘蜈蚣素、Nigrocin-HLM和Hs02共5種短鏈AMP對偽中間型葡萄球菌、科氏葡萄球菌和犬小孢子菌等犬常見皮膚病原菌的體外抗菌作用，評價其抗菌效果，以期為小動物臨床新型抗菌制劑的開發提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 抗菌肽 獨角仙素、大鯢血素、模棘蜈蚣素、Nigrocin-HLM和Hs02(氨基酸序列分別為：AAVTRRILCWFA、GLTRLFSVIK、VAEARQGSFSY、GLLSGILGAGKKIVF和KWAVRIIRKFIKGFIS)，均由吉爾生化生物科技有限公司通過標準固相方法合成，反相高效液相層析檢測純度均為99%以上。

1.2 菌株 分離自膿皮癥患犬和皮膚真菌感染患犬的偽中間型葡萄球菌、科氏葡萄球菌和犬小孢子菌臨床分離菌株。

1.3 主要試劑 米勒-欣頓二氏(Mueller-Hinton,MH)培養基、腦心浸出液(Brain heart infusion,BHI)培養基、沙氏葡萄糖(Sabouraud dextrose,SD)培養基，均購自北京奧博星技術有限公司；阿莫西林三水物、鹽酸特比萘芬、氯化三苯基四氮唑(Triphenyltetrazolium chloride,TTC)和3,3′-[1-(苯氨酰基)-3，4-四氮唑]-二(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸鈉[2，3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl]-2H-tetrazolium hydroxide,XTT]，均購自北京索萊寶科技有限公司；RPMI-1640培養基，購自Gibco公司。

1.4 藥液配制 將5種AMP和阿莫西林固體粉末溶于去離子水，分別配制成濃度為4 096 μg/mL和2.5 mg/mL的儲備液；用無水乙醇將鹽酸特比萘芬固體粉末溶解配制成濃度為50 mg/mL的儲備液；將TTC和XTT固體粉末用無菌水溶解配制成濃度為2 g/mL的儲備液。過濾除菌后置于4 ℃保存備用。

1.5 菌懸液制備

1.5.1 細菌 活化細菌在BHI液體培養基37 ℃振蕩培養12 h，10倍倍比稀釋后，菌液涂布于BHI固體培養基。37 ℃培養24 h后進行菌落計數，推算原菌懸液濃度。最后使用生理鹽水調節濃度至1×105CFU/mL。

1.5.2 真菌 活化真菌在SD瓊脂培養基30 ℃培養6～8 d，沖洗并刮取培養基表面菌苔，過濾取上清液于血細胞計數板，在光鏡下觀察，計算原液真菌孢子濃度，調節濃度至1×103CFU/mL。

1.6 最小抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration,MIC)測定

1.6.1 微量稀釋 (1)細菌：將AMP儲備液稀釋成濃度為1 024 μg/mL的工作液。在96孔板第1～12孔中加入40 μL MH液體培養基后，取40 μL AMP工作液加入第1孔，連續2倍倍比稀釋至第10孔，使每孔藥物濃度為512～1 μg/mL。第11孔加入40 μL阿莫西林溶液作為陽性對照，第12孔加入40 μL生理鹽水作為陰性對照。最后向第1～11孔分別加入40 μL細菌懸液，于37 ℃培養18～24 h。(2)真菌：在96孔板第1～12孔中加入40 μL RPMI-1640培養基。預試驗確定AMP工作液的初始濃度為10 μg/mL。AMP工作液倍比稀釋方法以及陽性、陰性對照設置同上。最后向第1～11孔分別加入40 μL 1×103CFU/mL真菌懸液，于30 ℃培養6 d。

1.6.2 結果判定 (1)細菌：培養18～24 h后，肉眼觀察記錄是否出現液體渾濁或孔底菌落沉淀。加入2% TTC 5 μL，37 ℃培養3～4 h后觀察結果。以未見液體渾濁、孔底菌落沉淀或液體紅色孔對應的最小AMP濃度作為該AMP對該受試細菌的MIC。(2)真菌：培養6 d后，肉眼觀察記錄是否出現液體渾濁或孔底真菌菌落。以未見液體渾濁或孔底真菌菌落孔對應的最低AMP濃度作為該AMP對該受試真菌的MIC。

1.7 最小殺菌濃度(Minimum bactericidal concentration, MBC)測定

1.7.1 平板培養 (1)細菌： 取40 μL無菌生長孔溶液平板劃線接種于BHI固體培養基，于37 ℃培養18～24 h后觀察結果。(2)真菌：取40 μL無菌生長孔溶液平板劃線接種于SD固體培養基，于30 ℃培養6 d后觀察結果。

1.7.2 結果判讀 無菌生長平板所對應最低濃度為MBC。

1.8 殺菌曲線測定 取5份100 μL含菌量約為5×105CFU/mL的MH液體培養基，分別加入等量0.5×MIC、1×MIC、2×MIC、4×MIC抗菌肽和生理鹽水，37 ℃振蕩培養，分別于0 min、20 min、40 min、60 min、80 min、100 min、2 h、3 h、5 h取菌懸液，進行10倍倍比稀釋后涂板計算原菌懸液濃度，計算平均值并作出時間殺菌曲線圖[5]。

1.9 最低生物膜抑制濃度(Minimum biofilm inhibitory concentration, MBIC)測定 (1)細菌：在96孔板第1～12孔中加入40 μL MH液體培養基，AMP溶液倍比稀釋方法以及陽性、陰性對照設置同1.6.1。向第1～11孔加入40 μL細菌懸液后37 ℃培養18～24 h，用無菌生理鹽水將每孔洗滌3次，在超凈臺中倒置晾干。向第1～11孔中加入80 μL MH液體培養基和20 μL TTC溶液，37 ℃避光培養5 h后，470 nm測定吸光度。以吸光度測定值最小孔所對應AMP濃度作為該AMP對該受試細菌的MBIC。(2)真菌：在96孔板第1～12孔中加入40 μL SD液體培養基，AMP溶液倍比稀釋方法以及陽性、陰性對照設置同1.6.1。向第1～11孔加入40 μL真菌懸液后30 ℃培養6 d，每孔洗滌晾干后，向第1～11孔中加入80 μL SD液體培養基和20 μL XTT溶液，30 ℃避光培養24 h后，測定吸光度。以吸光度測定值最小孔所對應AMP濃度作為該AMP對該受試真菌的MBIC[6-8]。

1.10 最低生物膜清除濃度(Minimum biofilm eradication concentration, MBEC)測定 (1)細菌：在96孔板第1～12孔中加入40 μL MH液體培養基后，每孔加入等量細菌懸液(1×107CFU/mL)，37 ℃培養48 h后獲得成熟生物膜。無菌生理鹽水洗滌并倒置晾干后采用倍比稀釋法設置AMP濃度梯度，方法同1.6.1。37 ℃恒溫培養20～24 h后，重復洗滌操作。最后向第1～11孔中加入80 μL MH液體培養基和20 μL TTC溶液，37 ℃避光培養5 h后，470 nm測定吸光度。以吸光度測定值最小孔所對應AMP濃度作為該AMP對該受試細菌的MBEC。(2)真菌：在96孔板第1～12孔中加入40 μL SD液體培養基后，每孔中加入等量真菌懸液(1×103CFU/mL)，30 ℃培養6 d后獲得成熟生物膜。無菌生理鹽水洗滌并倒置晾干后采用倍比稀釋法設置AMP濃度梯度，方法同1.6.1。30 ℃恒溫培養24 h后，重復洗滌操作。向第1～11孔中加入80 μL SD液體培養基和20 μL XTT溶液，30 ℃避光培養24 h后，測定吸光度。以吸光度測定值最小孔所對應AMP濃度作為該AMP對該受試真菌的MBEC[6-8]。

1.11 聯合用藥試驗 (1)細菌：在96孔板第1～12孔中加入40 μL 細菌懸液(1×105CFU/mL)后，加入1/4×MIC的AMP溶液(該濃度AMP單獨作用不抑制病原生長)。聯合用藥所用另一種受試藥物濃度梯度及陽性對照和陰性對照設置方法同1.6.1。于37 ℃培養18～24 h后觀察結果。(2)真菌：在96孔板第1～12孔中加入40 μL真菌懸液(1×103CFU/mL)后，加入1/4×MIC的AMP溶液。聯合用藥所用另一種受試藥物濃度梯度及陽性對照和陰性對照設置方法同1.6.1。于30 ℃培養6 d后觀察判定結果。依次計算分級抑制濃度(Fractional inhibitory concentration, FIC)和分級抑制濃度指數(Fractional inhibitory concentration index, FICI)，計算公式如下。

FICI=FIC(A)+FIC(B)

結果判定：FICI≤0.5，藥物A和B具有協同作用；FICI=1，藥物A和B具有相加作用；FICI≥4，藥物A和B具有拮抗作用；0.5≤FICI<4，藥物A和B具有無關作用[9]。

2 結果

2.1 MIC和MBC測定 獨角仙素、大鯢血素、模棘蜈蚣素、Nigrocin-HLM和Hs02對偽中間型葡萄球菌、科氏葡萄球菌、犬小孢子菌的MIC和MBC如表1所示。獨角仙素和大鯢血素對偽中間型葡萄球菌和科氏葡萄球菌的抗菌活性較強，明顯優于模棘蜈蚣素、Nigrocin-HLM和Hs02。5種受試AMP均對犬小孢子菌有較強的抗菌活性。

表1 MIC與MBC試驗結果Table 1 Results of MIC and MBC (μg/mL)

2.2 殺菌曲線測定 由于獨角仙素和大鯢血素均表現出了對犬常見皮膚感染病原的優良抗菌活性，所以挑選兩者進行后續試驗。殺菌曲線結果如圖1所示，2種受試AMP均能完全清除受試菌株；4×MIC 獨角仙素表現出了快速殺菌性能，在作用100 min和3 h后可完全殺死偽中間型葡萄球菌和科氏葡萄球菌；2×MIC獨角仙素在作用3 h和5 h后可完全殺死受試菌，表明獨角仙素的殺菌性能存在明顯的劑量、時間依賴效應；低濃度(0.5×MIC)獨角仙素可抑制受試菌生長；4×MIC和2×MIC大鯢血素分別在作用3 h和5 h后完全殺死偽中間型葡萄球菌和科氏葡萄球菌；>0.5×MIC 獨角仙素和大鯢血素均在作用2 h后表現出了強效抗真菌活性，且不同濃度的受試AMP在作用5h后均能完全清除犬小孢子菌。

圖1 殺菌曲線結果Fig.1 Results of time-kill curveA，C，E：獨角仙素殺菌曲線； B，D，F：大鯢血素殺菌曲線A,C,E: Time-kill curve of allomyrinasin; B,D,F：Time-kill curve of andricin B

2.3 MBIC和MBEC測定 獨角仙素和大鯢血素對偽中間型葡萄球菌和科氏葡萄球菌的MBIC和MBEC如表2所示。獨角仙素和大鯢血素相比模棘蜈蚣素能有效抑制細菌生物膜形成和清除成熟生物膜;獨角仙素對偽中間型葡萄球菌、科氏葡萄球菌生物膜作用比模棘蜈蚣素強;獨角仙素和大鯢血素能夠抑制犬小孢子菌生物膜形成和清除成熟生物膜。

表2 MBIC和MBEC測定結果Table 2 Results of MBIC and MBEC (μg/mL)

2.4 聯合用藥 獨角仙素和大鯢血素均表現出優越抗菌活性，與抗生素阿莫西林和特比萘芬的聯合給藥對偽中間型葡萄球菌、科氏葡萄球菌和犬小孢子菌的作用效果如表3所示。獨角仙素與大鯢血素聯合用藥，表現出了對偽中間型葡萄球菌、科氏葡萄球菌和犬小孢子菌的協同抗菌作用。獨角仙素與阿莫西林聯合用藥，對受試偽中間型葡萄球菌、科氏葡萄球菌具有協同抗菌作用。大鯢血素與阿莫西林聯合用藥，對科氏葡萄球菌表現出協同抗菌作用，對偽中間型葡萄球菌呈無關作用。此外，獨角仙素和大鯢血素分別與特比萘芬聯合用藥，均對犬小孢子菌具有協同抗菌作用，表明其相對優越的抗菌效能。

表3 聯合用藥結果Table 3 Results of combination therapy analysis

3 討論

從昆蟲等動物中提取的AMP是一種重要的殺菌物質，能有效清除細菌、真菌等多種病原[3]。本試驗選取昆蟲、動物提取分離的短鏈獨角仙素、大鯢血素和模棘蜈蚣素及人工設計的Nigrocin-HLM和Hs02，經化學固相合成后進行體外抗菌研究。

本試驗選取的5種短鏈AMP對引起皮膚及軟組織感染的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌和白色念珠菌等病原有著理想的抗菌活性[10]。本試驗結果顯示，獨角仙素和大鯢血素對偽中間型葡萄球菌、科氏葡萄球菌和犬小孢子菌有著較強的抗菌活性，同時能夠抑制細菌生物膜的形成和清除成熟的生物膜，并有著與臨床傳統抗菌藥阿莫西林、抗真菌藥特比萘芬協同作用的優勢，提示其具有作為臨床治療犬常見感染性皮膚病藥物的潛力。

MIC試驗結果顯示，盡管獨角仙素、模棘蜈蚣素、大鯢血素、Nigrocin-HLM和Hs02在前期試驗對葡萄球菌等革蘭陽性菌表現出優良的抗菌活性，但對偽中間型葡萄球菌、科氏葡萄球菌等臨床分離株表現出一定的選擇性，可能與結構和抗菌活性結構域相關[11]。

獨角仙素和大鯢血素與特比萘芬聯用均具有協同作用。有研究表明，使用高劑量的特比萘芬，容易產生肝腎毒性，所以使用低濃度的藥物以盡可能減少其副作用[2]。此外，在受試AMP與抗菌藥物之間沒有發現拮抗作用。總的來說，聯合使用AMP和抗菌藥物產生協同作用，可能是AMP與抗菌藥物不同的作用機制所致。AMP通常作用于病原的細胞膜導致其裂解或增加細胞膜的通透性，以至于抗菌藥物能夠更多地進入細胞，加強殺菌作用[12-13]。對于受試AMP對病原的作用機制，有待進一步研究。

結果表明，獨角仙素和大鯢血素對偽中間型葡萄球菌、科氏葡萄球菌和犬小孢子菌有著良好的抗菌活性，且能夠抑制偽中間型葡萄球菌生物膜的形成，提示獨角仙素和大鯢血素具有作為臨床治療犬常見感染性皮膚病藥物的潛力。