高通量測序比較分析被咬犬傷口及其周邊皮膚的菌群特征

關 珊 ， 王少林 ， 吳聰明

(1.中國農業大學動物醫學院 ， 北京 海淀 100193 ； 2.中農大動物醫院有限公司，北京 海淀 100193)

寵物犬戶外活動時經常發生斗毆，易導致咬傷。犬被咬傷口的菌群特征國內未見相關研究，國外報道也極少，僅見常規分菌方法獲得的調查結果。咬傷傷口厭氧菌與需氧菌混合存在，與其他傷口大部分由需氧菌組成不同[1-3]。本試驗應用16S rDNA高通量測序技術[4]比較分析犬咬傷周邊皮膚和咬傷傷口的菌群，旨在更全面地了解咬傷傷口菌群組成與影響因素，為臨床治療寵物犬咬傷時合理選用抗菌藥物提供理論依據，以提高藥物的有效性和治愈率。

1 材料與方法

1.1 試驗對象 選取2019年6月—11月來中國農業大學動物醫院就診的10只咬傷犬。就診前傷口均未進行消毒、清洗或用藥，且傷犬1個月內未使用過抗菌藥物或微生態制劑。

1.2 試驗方法

1.2.1 采樣方法 采樣時用生理鹽水清洗傷口處污物，使用ESwabTM管的尼龍絨頭分別在傷口(傷口樣品)和周圍2～3 cm內的皮膚(皮膚樣品)反復擦拭。將采集樣品用冰袋保存，盡快送至蘇州金唯智生物科技有限公司進行測序分析。參與試驗的傷犬主人均知曉采樣目的并同意參與試驗。

1.2.2 樣品分析 采用16S rDNA測序分析傷口樣品和皮膚樣品的菌群結構。測序流程包括樣品基因組DNA提取與質檢、16S rDNA可變區擴增與測序文庫構建、高通量測序等，每個環節均進行嚴格質控。對每個樣品測序原始數據進行去接頭和低質量過濾處理，然后去除嵌合體序列，得到有效序列后進行聚類分析，每一個聚類稱為一個物種操作單元(Operational taxonomic units，OTU)，對OTU的代表序列作分類學分析，得到各樣品的物種分布信息。

1.3 多樣性分析 基于OTU分析結果，對各個樣品進行α多樣性指數分析，得到各樣品物種豐富度和均勻度信息等；基于分類學信息，在各個分類水平上進行群落結構統計分析；通過計算UniFrac距離、繪制PCoA圖等，展示不同樣品或兩類樣品之間的菌群結構。最后通過Anosim分析和Metastats差異分析，得到樣品之間的菌群結構差異性。

2 結果

2.1 OTU聚類分析 利用Qiime(1.9.1)和Vsearch(1.9.6)軟件在97%的相似水平下對10只咬傷犬的傷口樣品(10個)和傷口周邊皮膚樣品(10個)的細菌16S rDNA測序得到的每條序列進行OTU聚類分析，制作Venn圖。結果如圖1所示，皮膚樣品和咬傷樣品之間高相似度的OTU有280個，分別占皮膚樣品和咬傷樣品OUT的90.6%和99.3%。

圖1 皮膚和咬傷樣品細菌16S rDNA測序OUT數目的Venn圖Fig.1 Venn diagram of bacterial 16S rDNA sequencing OUT number of skin and bite samples

2.2 物種注釋 依據高通量測序獲得的序列信息，在門水平和屬水平上分析兩類樣品的菌群組成和相對豐度，結果見圖2。

根據相對豐度將樣品中的菌門、屬分為優勢菌門、屬(相對豐度≥1.0%)和次要菌門、屬(相對豐度<1.0%)，且將次要菌門、屬歸類于其他[5]。在菌門水平上選取兩類樣品最大相對豐度排名前14位的物種制作相對豐度分布柱形圖(圖2A)，結果發現：皮膚樣品的優勢菌門依序為變形菌門(44.5%)、厚壁菌門(35.2%)、擬桿菌門(12.3%)、梭桿菌門(3.3%)、放線菌門(2.6%)和Patescibacteria(1.2%)，其余為次要菌門；咬傷樣品的優勢菌門依序為變形菌門(57.1%)、厚壁菌門(20.0%)、擬桿菌門(16.1%)、放線菌門(4.6%)和梭桿菌門(2.0%)，其余為次要菌門。其中，變形菌門的相對豐度在皮膚樣品和咬傷樣品中均最高。

圖2 基于16S rDNA測序獲得的皮膚和咬傷樣品菌群組成和相對豐度Fig.2 Bacterial composition and relative abundance of skin and bite samples based on 16S rDNA sequencingA:菌門水平; B.菌屬水平A:Phylum level of bacteria; B:Genus level of bacteria

在菌屬水平上選取兩類樣品最大相對豐度排名前30位的物種制作相對豐度分布柱形圖(圖2B)，結果發現：皮膚樣品的優勢菌屬依序為葡萄球菌屬(19.4%)、嗜冷桿菌屬(10.6%)、克雷伯菌屬(8.5%)、莫拉菌屬(5.1%)、擬桿菌屬(3.8%)、梭桿菌屬(3.2%)、卟啉單胞菌屬(2.6%)、消化鏈球菌屬(2.5%)、伯杰菌屬(2.3%)、乳桿菌屬(2.3%)、f_Enterobacteriaceae_Unclassified(2.2%)、Frederiksenia(2.1%)、巴氏桿菌屬(1.9%)、Corticibacter(1.8%)、放線桿菌屬(1.6%)、奈瑟菌屬(1.4%)、[Eubacterium]_coprostanoligenes_group(1.3%)、嗜二氧化碳嗜纖維菌屬(1.3%)、f_Cardiobacteriaceae_Unclassified(1.2%)、f_Lachnospiraceae_Unclassified(1.1%)和大腸埃希菌(1.0%)，其余為次要菌屬；咬傷樣品的優勢菌屬依序為巴氏桿菌屬(17.8%)、擬桿菌屬(12.5%)、克雷伯菌屬(9.7%)、巨球菌屬(6.5%)、葡萄球菌屬(6.4%)、奈瑟菌屬(5.7%)、Frederiksenia(5.0%)、莫拉菌屬(4.0%)、鏈球菌屬(2.6%)、大腸埃希菌(2.4%)、谷氨酸桿菌屬(2.1%)、消化鏈球菌屬(2.1%)、伯杰菌屬(1.9%)、梭桿菌屬(1.8%)、亮桿菌屬(1.8%)、f_Cardiobacteriaceae_Unclassified(1.5%)、勞特羅普氏菌屬(1.5%)、勞特菌屬(1.4%)、藤黃單胞菌屬(1.1%)和不動桿菌屬(1.0%)，其余為次要菌屬。其中，葡萄球菌屬和巴氏桿菌屬分別是皮膚樣品和咬傷樣品中相對豐度最高的菌屬。

2.3 α多樣性分析 對樣品的細菌16S rDNA測序OUT數目進行α多樣性分析可以反映其菌群的物種豐度和均勻度。α多樣性指數包括Chao1指數、ACE指數、Shannon指數和Simpson指數等。Chao1指數值和ACE指數值越大，表明菌群的物種豐度越高；Shannon指數值越大，表明菌群的多樣性越高；Simpson指數值越大，說明菌群的多樣性越低。利用Qiime(1.9.1)軟件對10只犬的兩類樣品的OUT數目進行α多樣性分析。結果如表1所示，10只咬傷犬20個樣品的覆蓋率(Coverage指數)均>98%，提示測序結果能真實反映樣品的實際情況。20個樣品中，ACE指數和Chao1指數降序排名前7位的樣品均來自皮膚，皮膚樣品的平均Shannon指數和Simpson指數分別高于和低于咬傷樣品，表明皮膚樣品的物種豐富度和多樣性較咬傷樣品更高。

表1 皮膚和咬傷樣品細菌16S rDNA測序OUT數目的α多樣性分析結果Table 1 The α diversity analysis of bacterial 16S rDNA sequencing OUT numbers in skin and bite samples

2.4 β多樣性分析 主坐標分析(PCoA分析)是β多樣性分析的一種。通過分析不同樣品的菌群分布，利用R語言基于Brary-Curtis距離矩陣進行PCoA作圖分析。圖中20個點代表20個樣品，點與點之間的距離越近代表其菌群相似性越高。結果如圖3所示，皮膚樣品和咬傷樣品并沒有呈現出明顯的聚集，而同一只犬的2個樣品聚集在一起。說明同一只犬的2個樣品菌群組成較相似，可能存在相關的聯系。不同患犬之間的個體差異較大，組間差異并不顯著。

圖3 各個樣品菌群組成的PCoA分析Fig.3 Principal coordinate analysis of bacterial composition in each sample

2.5 群落結構差異顯著性分析

2.5.1 Anosim分析 Anosim分析是一種基于樣品間距離矩陣的非參數檢驗，R值和P值用來表示組內和組間是否存在差異及差異是否顯著。R值值域為[-1～1]，接近-1表示組內差異大于組間差異；接近0表示組間和組內沒有差異，接近于1表示組間差異大于組內差異。本試驗中皮膚樣品和咬傷樣品之間比較R值為-0.043，介于0～-1，P為0.75(P>0.05)，可知皮膚樣品和咬傷樣品的組內差異大于組間差異，但差異不顯著，即樣品菌群組成受犬只個體差異影響較大。

2.5.2 Metastats差異分析 Metastats差異分析是基于樣品的不同物種豐度數據，利用Metastats軟件檢測豐度差異，從而得出差異物種。結果顯示皮膚樣品和咬傷樣品中的差異最大的5個菌種分別為Candidatus_Saccharimonas、Conchiformibiu、[Eubacterium]_coprostanoligenes_group、Lachnospiraceae_NK4A136_group和乳桿菌屬，毛螺菌科NK4A136屬和乳桿菌屬在2種樣品間的差異顯著(P<0.05)。其中Lachnospiraceae_NK4A136_group僅存在于皮膚樣品中，且所有差異物種在皮膚樣品中的豐度均大于咬傷樣品。

3 討論

本試驗發現，被咬犬傷口的優勢菌主要由巴氏桿菌、擬桿菌、克雷伯菌、巨球菌和葡萄球菌等20種菌組成，與犬的其他傷口相比[6]，厭氧菌的大量存在是咬傷傷口的特征。豐度較大的前幾種優勢菌種類與前人調查結果一致，但優勢菌種類數目和某些優勢菌的豐度要遠大于前人報道[7-10]，是因為16S rDNA高通量測序技術相比于傳統的細菌分離方法得到的菌群信息更加全面、準確[5]。

多種分析結果顯示，被咬犬傷口與傷口周邊皮膚的菌群在豐度和多樣性上雖有差異，但差異并不顯著，且二者均存在葡萄球菌、克雷伯菌、奈瑟菌、莫拉菌、大腸埃希菌等共同優勢菌，故有理由推測咬傷傷口的菌群主要受皮膚菌群的影響，亦有文獻證明犬皮膚破損處菌群可能來自自身菌群[11-12]。

與傷口周邊皮膚的菌群相比，被咬犬傷口還存在大量的犬口腔細菌[7,13]，比如巴氏桿菌、擬桿菌等。在撕咬或舔舐傷口過程中，口腔菌常侵染傷口，故推測犬口腔菌群是影響被咬犬傷口菌群的另一因素。

綜上，本試驗發現犬咬傷傷口菌群以巴氏桿菌和厭氧菌如擬桿菌等為主，主要受犬傷口周邊皮膚菌群和口腔菌群的影響。