新孢子蟲分泌蛋白的種類及其功能

吳凱劍 ， 劉 群

(中國農業大學動物醫學院 ， 北京 海淀 100193)

犬新孢子蟲(Neosporacaninum，簡稱新孢子蟲)由Dubey等于1988年鑒定并命名[1]，是多種動物共患原蟲，終末宿主是犬科動物，中間宿主是包括犬在內的多種溫血動物，主要寄生于中樞神經系統、肌肉組織和視網膜等器官組織的有核細胞中。新孢子蟲病已是公認的致牛流產的主要原因之一。新孢子蟲隸屬于頂復合器亞門、真球蟲目、肉孢子蟲科、新孢子蟲屬，如圖1所示，其具有該類原蟲的三大重要的分泌細胞器，即微線體、棒狀體和致密顆粒，是蟲體分泌蛋白的主要來源，蟲體的表面蛋白和其他分泌排泄產物也是重要的分泌蛋白。已知分泌蛋白在蟲體黏附、入侵、增殖以及逸出等生命活動中具有重要作用，其中有些蛋白是影響新孢子蟲毒力的重要因子，或是重要的診斷抗原和免疫原。目前已有新孢子蟲的多種分泌蛋白得到鑒定，對它們的功能也有一定的認識，本文對新孢子蟲主要分泌蛋白的研究報道進行總結和分析，以期為新孢子蟲的深入研究提供參考資料。

圖1 新孢子蟲分泌蛋白在入侵時的功能A:新孢子蟲的超微結構示意圖; B:新孢子蟲入侵宿主時蛋白分泌示意圖(①:新孢子蟲以低親和力接觸到宿主細胞膜；②:微線體分泌微線體蛋白，介導蟲體以更強的親和力黏附在細胞表面；③:棒狀體分泌棒狀體頸部蛋白和棒狀體蛋白；④、⑤：棒狀體頸部蛋白與微線體蛋白形成滑動連接，推動蟲體進入宿主細胞；⑥：新孢子蟲進入宿主細胞后進行二分裂，逐漸形成納蟲空泡，蟲體分泌致密顆粒蛋白和棒狀體蛋白修飾納蟲空泡。部分致密顆粒蛋白和棒狀體蛋白能夠定位于宿主細胞核，向宿主細胞核傳遞信號，調控宿主細胞周期)

1 微線體蛋白(Microneme protein，MICs)

在頂復亞門不同屬、種和同一蟲種的不同發育階段中，微線體的數量差異很大，通常代謝旺盛或滑動活躍的蟲種或發育階段蟲體含有較多的微線體，而運動較少或不活躍的、非入侵宿主階段的原蟲則含有較少或者沒有微線體。新孢子蟲速殖子含有豐富的微線體蛋白，在運動、黏附和入侵過程中起重要作用。

新孢子蟲的分泌蛋白中，關于微線體蛋白的研究報道最多。目前，已經鑒定出新孢子蟲NcMIC1、NcMIC2、NcMIC3、NcMIC4、NcMIC6、NcMIC8、NcMIC10、NcMIC26、類枯草桿菌絲氨酸蛋白酶1(Subtilisin-like serine protease 1，NcSUB1)、頂膜抗原1(Apical membrane antigen 1，NcAMA1)和NcMIC2的同系物NcMIC2-like等多種微線體蛋白。

1.1 成熟分泌 微線體蛋白有一些共同結構特征，其一是具有前體和成熟體2種形式。除了NcAMA1，大多數微線體蛋白都為I型跨膜蛋白，含有C端跨膜結構域和N端信號肽。微線體蛋白前體的跨膜結構域會在微線體中或在分泌前被切割成成熟體，然后在信號肽引導下定位到正確位置，切割新孢子蟲微線體蛋白的酶尚不清楚。成熟的微線體蛋白在蟲體入侵細胞前定位在微線體中，入侵過程或入侵后大量地集中在速殖子后端。

微線體蛋白的分泌受到蟲體內鈣離子的調控，蟲體黏附細胞后，體內鈣離子濃度升高刺激微線體蛋白分泌。NcMIC3比較特殊，其分泌不受鈣離子調控，并且不嚴格地定位在微線體上。在胞外或進行入侵時，NcMIC3以溫度依賴性形式彌散分布在蟲體表面，隨后向蟲體后端轉運，完成入侵后定位于微線體[2]。

1.2 黏附結構域 微線體蛋白的另一個重要特征是大多數都具有1個或多個黏附結構域，屬于黏附蛋白，能與宿主細胞直接結合，便于入侵。目前已經鑒定出多種新孢子蟲微線體蛋白的黏附結構域，大多數與其他真核生物的黏附結構域有較高的同源性。包括整合素樣結構域(I或A結構域)和5個血小板反應蛋白重復序列(Thrombospondin domains，TSP)、唾液酸結合黏附重復結構域(Microneme adhesive repeat，MAR)、表皮生長因子樣結構域(EGF-like domain，EGF)和Apple域[2-3]。在其他的原蟲中，還發現了包括小隱孢子蟲的黏蛋白樣結構域、瘧原蟲的Duffy樣結合結構域 (Duffy binding-like domain，DBL)和泰勒蟲的富含半胱氨酸的結構域[2,4-5]。

微線體蛋白的黏附結構域與宿主表面受體(糖蛋白或糖脂復合物)結合，使蟲體黏附在細胞表面，這是新孢子蟲入侵宿主細胞的基礎。微線體蛋白識別的受體包括肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸軟骨素以及人工硫酸化的糖胺聚糖-葡聚糖硫酸鹽等。已有研究證實，NcMIC1、3、4在體外能夠與宿主細胞表面的多硫酸化糖胺聚糖(NcMIC1、3)或硫酸軟骨素(NcMIC4)結合[2,6-7]，干擾硫酸化蛋白多糖的合成或抑制其硫酸化過程。寄生蟲的黏附結構域是潛在的藥物靶點，結合生物信息學分析黏附結構域的晶體結構，解析其與宿主細胞互作的蟲體特異性結合位點，對結合位點進行突變或者利用虛擬篩選尋找針對結合位點的小分子抑制劑，有助于研發有效的弱毒活疫苗或者藥物。已有瘧原蟲DBL結構域的特異性結合位點為DBL3X-DBL4ε[4]，但是在新孢子蟲中相關的研究還很少。

微線體蛋白和宿主細胞的結合與膜肌動蛋白-肌球蛋白運動蛋白互相有關，對蟲體運動至關重要。NcMIC2的TRAP樣蛋白結構域(Thrombospondin-related anonymous protein，TLP)是頂復亞門原蟲滑動體的組件蛋白，參與蟲體運動[4]。NcMIC6通過參與蟲體的滑移運動從而促進蟲體從細胞中逸出[8]。

1.3 微線體蛋白復合物 微線體蛋白在運輸和分泌過程中均以復合物形式發揮作用。在弓形蟲中已經報道了4種互作的微線體蛋白復合物：TgMIC1/4/6、TgMIC2/M2AP(MIC2相關蛋白)、TgMIC3/8和TgAMA1/RON2/4/5/8(棒狀體頸部蛋白2/4/5/8)，并且證明了AMA1/RON2/4/5/8復合物與運動連接(Moving junction，MJ)結合，對入侵至關重要[9]。在新孢子蟲中，通過免疫共沉淀已經鑒定出NcMIC1/4/6和NcMIC3/NcMIC8兩對復合物[8,10]。與弓形蟲不同的是，新孢子蟲NcMIC6不影響NcMIC1和NcMIC4的定位，說明了新孢子蟲和弓形蟲入侵的機制存在差異[8]。

關于新孢子蟲微線體蛋白如何參與蟲體入侵過程及微線體蛋白復合體的功能仍有待深入研究。

2 棒狀體蛋白(Rhoptry protein，ROPs)

棒狀體位于新孢子蟲前端，其數量與生活史階段有關。棒狀體又分為頸部和球部，分別分泌棒狀體頸部蛋白(Rhoptry neck protein，RONs)和棒狀體蛋白(Rhoptry protein，ROPs)。新孢子蟲中關于RONs的研究很少。

2.1 定位與功能 棒狀體蛋白是頂復亞門原蟲特有的蛋白家族，在寄生蟲侵入細胞前后分泌，其功能與定位相關。有些棒狀體蛋白定位于納蟲空泡膜(Parasitophorous vacuole membrane，PVM)，在入侵時與宿主蛋白互作，或在胞內與致密顆粒蛋白一起修飾和維持納蟲空泡膜和納蟲空泡網絡(Parasitophorous vacuole network，PVN)；有些定位于宿主細胞核，通過納蟲空泡(Parasitophorous vacuole,PV)向宿主細胞核傳遞信號調節寄生蟲的毒力；另一些定位在宿主細胞質，發揮重塑宿主的肌動蛋白細胞骨架的功能。棒狀體蛋白為新孢子蟲重要的毒力因子，也是抵御宿主防御系統的關鍵。

2.2 ROP2蛋白家族 根據棒狀體蛋白的功能，分為不同蛋白家族。最大的棒狀體蛋白家族為ROP2家族，也被稱為棒狀體激酶家族(Rhoptry kinases，ROPKs)，分為激酶和假激酶。新孢子蟲ROPs中，已報道的NcROP2Fam-1、NcROP2、NcROP5、NcROP16、NcROP18和NcROP40都屬于ROP2家族。雖然弓形蟲和新孢子蟲的許多ROPKs具有同源性，但是兩者編碼毒力因子的結構域有顯著的差別，ROPKs的表達水平也不同。不同蟲株、寄生蟲不同生活史階段的ROPKs表達水平也存在顯著差異。這是導致寄生蟲毒力差異的關鍵。

ROP2家族的共同特征是在信號肽切割位點后含有富含精氨酸(R-rich)的結構域，另外還有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結構域(NTE)。前者是由3個R-rich結構域組成，其核心是1個疏水性α螺旋，影響ROP2家族蛋白與納蟲空泡膜的結合[11]。后者決定了ROPKs的激酶磷酸化活性。但是并非所有ROPKs都含關鍵的催化殘基，而許多假激酶已經進化出替代磷酸化的方式[12]。真核生物的蛋白激酶起到介導信號轉導的作用，所以棒狀體激酶家族是非常重要的毒力家族，也是很有前途的免疫抗原，發掘更多的ROPKs及研究其功能對研究新孢子蟲病的致病機理至關重要。

目前已經報道了幾種重要的ROP2家族毒力因子，最先被表達克隆的是NcROP2，定位于PVM，通過與宿主互作參與寄生蟲入侵過程[11]，另一個ROPs家族蛋白NcROP2Fam-1也影響蟲體的入侵過程，但是由于NcROP2Fam-1缺乏必要的激酶催化殘基，所以尚未清楚其是否有激酶活性。

TgROP18是第1個被報道的弓形蟲毒力因子，與TgROP17和假激酶TgROP5形成復合物，受到TgGRA7的調控，使免疫相關的GTPase家族(IGRs)磷酸化，發揮免疫逃避作用[12]。NcROP18卻是1個假基因[13]，ROP18基因的不同是造成弓形蟲和新孢子蟲毒力差異的關鍵因素。

NcROP5是新孢子蟲的毒力因子之一[14]，能抑制IGRs的鳥苷酸結合蛋白GBP1和GBP2向納蟲空泡聚集，抵御宿主對新孢子蟲的泛素化和降解納蟲空泡。缺失NcROP5會影響NcROP17和NcGRA7的轉錄水平。

NcROP16也是重要的毒力因子之一[15]，定位于宿主細胞核和細胞漿，由磷酸激酶介導在宿主細胞中磷酸化信號轉導和轉錄激活因子3(STAT3)，誘導宿主的凋亡。

3 致密顆粒蛋白(Dense granule protein，GRAs)

目前，已經報道的致密顆粒蛋白有NcGRA1、NcGRA2、NcGRA3、NcGRA4、NcGRA6、NcGRA7、NcGRA9、NcGRA11、NcGRA12、NcGRA14、NcGRA17、NcGRA23、核苷水解酶(NcNTPase)和基質抗原1(Matrix antigen 1，NcMAG1)等。

3.1 分泌與定位 大多數致密顆粒蛋白都包含1個N端信號肽和跨膜結構域，并且具有翻譯后修飾。致密顆粒蛋白分泌前定位于致密顆粒，在PVM形成初期以類似于胞吐的方式從寄生蟲頂端、側面和后部分泌，其分泌機制尚不清楚。已知致密顆粒蛋白的分泌不受鈣離子調控，卻受溫度影響[16]，原因未知。

致密顆粒蛋白分泌后有3種定位形式：定位于納蟲空泡膜、定位于納蟲空泡腔和定位于納蟲空泡中的網管狀纖維網絡。

3.2 功能及機制 致密顆粒蛋白主要功能是修飾PVM，維持納蟲空泡的形態穩定，促進速殖子在納蟲空泡中的營養攝取和物質交換，維持新孢子蟲在宿主細胞中的正常生長和復制。Yang等[17]證明了NcGRA17的α螺旋是維持納蟲空泡的形態的必要條件。董井泉[18]發現，NcGRA2、NcGRA4、NcGRA6和NcGRA9能形成一種與PVN結構相關的復合體，其核心是NcGRA2，但是對該復合體的功能沒有做進一步研究。有些致密顆粒蛋白可能存在內質網滯留信號，參與PV與宿主ER細胞器的招募/結合；有些能介導PV與宿主細胞線粒體的結合；還有些能夠進入宿主細胞核，調控宿主細胞周期。

NcGRA7是第1個被報道的致密顆粒蛋白，被研究得最多。早期對NcGRA7的研究主要集中在定位、血清學診斷和免疫活性分析上。抗NcGRA7抗體具有特異性，與弓形蟲缺乏交叉反應，是很強的診斷標志物[19]。NcGRA7參與宿主的細胞和體液免疫，是重要的疫苗候選蛋白。

近年來對NcGRA7的研究多集中在致病機制上。一方面，NcGRA7通過調節宿主免疫反應調控新孢子蟲病的發病機制。NcGRA7與NcGRA6、NcGRA14參與調控NF-κB、鈣調神經磷酸酶和cAMP-PKA信號通路的激活[20]，影響宿主細胞因子和趨化因子的產生，如IFN-γ、IL-1β、IGPs和IRGs[19]，能夠抑制宿主IRGa6向PVM募集，從而逃避宿主免疫反應。NcGRA7還能調控多種與宿主細胞周期、泛素化、RAS信號相關的蛋白的表達。另一方面，NcGRA7影響新孢子蟲自身的復制，調節多種新孢子蟲基因的表達，包括代謝、轉運蛋白和抗原、泛素化、剪切和翻譯后修飾相關的基因[19]。因此，NcGRA7是新孢子蟲毒力的關鍵因子。NcGRA7與新孢子蟲中其他分子或宿主因子的互作、對基因調控的影響尚未見報道。

NcGRA6是第2個被報道的致密顆粒蛋白，具有抗原特異性，可用作新孢子蟲病的血清學診斷抗原。它同時以可溶性和跨膜形式存在，定位于PV和IVN。Zhao等[21]發現敲除NcGRA6會顯著抑制新孢子蟲的早期增殖，證明了NcGRA6是新孢子蟲感染早期的重要毒力因子，但是對NcGRA6的毒力機制沒有進一步研究。

NTPase具有NDPK(核苷二磷酸水解酶)活性，為I型核苷三磷酸水解酶(NTPDase)，屬于致密顆粒蛋白。該酶在速殖子階段大量分泌到PV，由PV中的二硫醇化合物或二硫醇氧化還原酶激活，能夠影響ATP的合成和蟲體分化，維持蟲體的營養獲取和介導GRA蛋白定位到PV和PVN[22]，維持PV的形態。NcNTPase缺乏NDPK活性，并且在強毒株中表達量更高。NcNTPaes和NcGRA7在入侵和逸出早期會上調并磷酸化[16]，說明二者可能在參與蟲體分裂周期中起到協同調控作用。

4 其他分泌蛋白

除了上述三大分泌蛋白，近年來報道的菱形蛋白酶(Rhomboids，ROM)也是重要的分泌蛋白，菱形蛋白酶作為一種絲氨酸蛋白酶，對蟲體入侵起關鍵作用，是重要的疫苗靶點。

目前在包括泰勒蟲、巴貝斯蟲、瘧原蟲和弓形蟲等多種頂復亞門原蟲中都有菱形蛋白酶的報道[23]，弓形蟲菱形蛋白酶能夠識別和切割黏附素，使蟲體不再黏附于宿主表面，從而進入宿主細胞中。菱形蛋白酶還在線粒體融合、生長因子信號傳導中發揮重要作用[24]。目前尚未有關于新孢子蟲菱形蛋白的報道，但是ROM基因的氨基酸序列在頂復門原蟲中保守，其功能可能也相似。

5 展望

新孢子蟲病對養牛業危害嚴重，是近年來備受重視的寄生蟲病，至今沒有有效的藥物和疫苗用于該病的防控。分泌蛋白在新孢子蟲的生命活動中發揮重要作用，有些重要蛋白可能是研制新孢子蟲的藥物和疫苗的重要靶點。目前關于許多新孢子蟲分泌蛋白的研究較為淺顯，對其功能、機制及其在新孢子蟲病防控中的作用均需深入研究。當前，新的生物學技術不斷開發和應用，為新孢子蟲病的深入研究提供了更好的機會，新孢子蟲分泌蛋白的鑒定、功能及其作用機制的深入研究，能夠為全面解析其致病機制和防控技術的研發提供科學依據。