潰瘍性結腸炎患者血清外泌體miRNA-221水平及臨床意義

董麗麗 李 珍 徐 蓉 丁 芳 李華銘

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)在我國的發生率逐年升高，已有研究證實，西化的生活方式、飲食、環境、基因和自身免疫因素均可能導致UC的發生。研究發現，UC發病反復等特點可增加患結直腸癌的風險。既往研究表明，UC患者患癌的標準化發生率為3.7%～5.7%。近年來研究指出，實際UC轉罹患癌的概率已大幅降低，可能與改善治療管理有關。結腸鏡檢查是判斷UC患者腸道黏膜狀況的金標準，但其屬于侵入性檢查，耗時較長且不能實時動態評估患病情況。因此，臨床上篩選出敏感、準確的生物學標志物，對于改善患者的預后至關重要。微RNA(microRNA，miRNA)是一種小的非編碼RNA，長度為18～25個核苷酸。miRNAs廣泛參與UC的病理生理過程，其在UC活動期與緩解期的表達均有所不同。據報道，miRNA-221可通過轉錄后基因沉默機制促進結直腸癌的發生、發展。本研究擬通過檢測UC患者血清外泌體miRNA-221的表達水平探討其具有的臨床意義，以期為臨床診療提供參考。

對象與方法

1.一般資料：選取2020年1月～2021年1月在筆者醫院收治的UC患者80例作為病例組，另選取同期60例健康體檢者作為對照組。本研究獲得筆者醫院醫學倫理學委員會批準(倫理學批號：KL201031)，所有研究治療和檢測方法均取得患者或家屬知情同意。納入標準：①診斷符合2012年廣州炎癥性腸病診斷與治療的共識意見；②年齡18～70歲。排除標準：①惡性腫瘤患者；②慢性心臟、肝臟、腎臟疾病患者；③伴有中毒性結腸擴張、結腸狹窄、梗阻、穿孔等；④檢查資料不完整的患者。收集患者的臨床基線數據包括年齡、性別、體重、吸煙史、紅細胞沉降率、基底漿細胞。

2.UC內鏡活動度分級：采用Mayo評分評價UC臨床活動度，包含4個評分項目，每項0～3分。(1)排便次數：①排便次數正常；②比正常排便次數增加1～2次/天；③比正常排便次數增加3～4次/天；④比正常排便次數增加5次/天或以上。(2)便血：①未見出血；②不到一半時間內出現便中混血；③大部分時間內為便中混血；④一直存在出血。(3)內鏡發現：①正常或無活動性病變；②紅斑、血管紋理減少、輕度易脆；③明顯紅斑、血管紋理缺乏、易脆、糜爛；④自發性出血、潰瘍形成。(4)醫生總體評價：①正常；②輕度病情；③中度病情；④重度病情。癥狀緩解：Mayo評分≤2分，輕度活動：3分≤Mayo評分≤5分；中度活動：6分≤Mayo評分≤10分；重度活動：11分≤Mayo評分≤12分。

3.UC嚴重度指數：采用UC內鏡下嚴重度指數(UCEIS評分)進行評分，包含血管紋理、出血情況、糜爛和潰瘍3個方面。血管紋理評分范圍為0～2分，出血情況為0～3分，糜爛和潰瘍為0～3分，分數越高代表越嚴重。輕度患者：2分≤UCEIS評分≤3分；中度患者：4分≤UCEIS評分≤6分；重度患者：7分≤UCEIS評分≤8分。

4.血清采集：患者入院隔日采集空腹靜脈血5ml，室溫靜止30min后，4℃ 4000r/min離心15min。取血清到新的收集管后，再4℃ 12000r/min離心10min除去細胞碎片，-80℃保存備用。

5.指標檢測：采用速率比濁法檢測C反應蛋白(CRP)水平，HE染色測定基底漿細胞，間接免疫熒光法檢測抗中性粒細胞胞質抗體(ANCA)。

6.試劑和儀器： SYBRPrimeScriptmiRNA RT-PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；PCRStripTubes購自美國Axygen公司；TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司；ABI-7300熒光定量PCR儀購自美國Ambion公司；引物設計與合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

7.引物設計與合成:根據GenBank序列設計引物，miRNA-221上游引物：5′-CAGCATACATGATTCCTTGTGA-3′；下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。內參β-actin上游引物:5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，下游引物：5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′。

8.實時定量PCR:用PrimeScriptRT-PCR試劑盒將樣本提取后的RNA轉化成cDNA，使用ABI-7500熒光實時定量PCR儀進行PCR擴增及檢測miRNA-221水平。miRNA-221及內參β-actin的擴增產物長度分別為110、112bp。RT-PCR反應體系：95℃預變性10min，95℃變性15s，60℃退火30s，最后72℃延伸30s，循環40次。

結 果

1.兩組一般臨床資料及血清miRNA-221比較：兩組年齡、性別、BMI比較，差異無統計學意義(>0.05)。病例組紅細胞沉降率、基底漿細胞、CRP、miRNA-221水平高于對照組(<0.05)，詳見表1。

2.不同內鏡活動度UC患者血清miRNA-221水平比較：重度活動組、中度活動組患者血清miRNA-221水平均高于輕度活動組，重度活動組血清miRNA-221水平高于中度活動組(均<0.05)，詳見表2。

3.不同UC嚴重度指數患者血清miRNA-221水平比較：重度、中度患者血清miRNA-221水平高于輕度患者，重度患者血清miRNA-221水平高于中度患者(均<0.05)，詳見表3。

4.UC患者血清miRNA-221水平與臨床參數相關性：血清miRNA-221與紅細胞沉降率、基底漿細胞、CRP、Mayo評分、UCEIS評分呈正相關(均<0.05)，詳見表4。

5.血清miRNA-221水平對UC、UC內鏡下活動度、UC嚴重程度的診斷價值：血清miRNA-221在預測發生識別UC、UC內鏡下活動度、UC嚴重程度的ROC曲線下面積(AUC)分別為0.786(95%CI：0.713～0.857)、0.674(95%CI：0.576～0.771)、0.801(95%CI：0.725～0.887)，詳見表5和圖1。

討 論

研究顯示，腫瘤或炎癥性疾病患者的circRNA可抑制miRNA功能，調控基因表達，從而影響表型。lncRNA H19可通過調控miRNA-675-5p表達，間接調控腸上皮細胞屏障功能相關蛋白VDR、ZO-1等的表達，從而導致UC發生。miRNA-221與多種炎性疾病關系密切，是一種功能性miRNA。既往研究指出，miRNA-221在UC患者中異常表達能通過調節炎性細胞因子水平參與到UC的發病過程。本研究結果提示，miRNA-221相對表達量是UC發病的危險因素，其發病可能與miRNA-221因子參與UC的發生、發展過程有關。研究表明，慢性炎癥與癌癥發展之間存在關聯。通過激活炎性細胞因子IL-6促進上皮細胞和免疫細胞正常分泌向惡性細胞轉變。據報道，結腸炎相關的結腸癌中已經發現有炎性反應，但尚不清楚這些炎癥是否與信號調節的通路相同。本研究顯示，miRNA-221作為炎癥效應分子在UC患者中表達失調，提示其在結直腸癌發生中的重要性。

目前，臨床上常用UCEIS評分和Mayo內鏡評分評價UC患者的黏膜病變程度，而Mayo內鏡評分以黏膜脆性為分級標準，由于知識和經驗掌握程度不同，致使各醫生對UC患者的評估結果各異，容易影響結果判斷的準確性。而UCEIS主要從糜爛和潰瘍、出血情況、血管紋理3方面進行黏膜病變評價，判斷標準上容易量化，對黏膜病變程度的評價更為細致。研究顯示，UCEIS評價UC患者臨床轉歸及遠期預后方面的準確度高于Mayo內鏡評分。本研究結果顯示，miRNA-221與UCEIS評分和Mayo內鏡評分密切相關，提示miRNA-221在UC患者臨床轉歸及遠期預后方面也可能發揮重大作用。研究表明，miRNA-221可參與調節單核細胞及巨噬細胞的分化等多種生理活動。此外，有多項研究表明，miRNA-221與肝癌、肺癌、乳腺癌、結直腸癌、口腔鱗狀細胞癌及膠質瘤等發生有關。

研究表明，miRNA-17-92、miRNA-21家族在腫瘤組織中常表達異常，非酒精性脂肪性肝病小鼠T細胞中可見170種miRNA，其中大部分通過MAPK信號通路表達下調。miRNA因其穩定性和多樣性等特點，被廣泛用于疾病治療、診斷以及預后評估，可作為分子標志物。慢性UC反復發作可演變為結直腸癌，是UC最嚴重的并發癥。基于miRNA-221在UC相關結腸癌患者中的獨特表達模式，其可能是UC發病機制中重要的調節因子。筆者研究結果表明，miRNA-221可以作為一種生物學標志物，用于識別有這種惡性轉化風險的患者。本研究還表明，miRNA-221表達水平與UC活動和疾病持續時間密切相關，這為當前臨床診療指南提供分子生物學基礎。

綜上所述，潰瘍性結腸炎血清miRNA-221水平升高，血清miRNA-221水平與潰瘍性結腸炎疾病嚴重程度呈正相關，其表達水平有助于早期識別評估UC的發展階段和疾病嚴重程度，可作為早期診治的生物學標志物。