體外誘導糖尿病小鼠模型中性粒細胞胞外誘捕網的研究

馬慧可 李 萍 陳 佳 劉 欣 姚文濤 林 燕 何秀娟

糖尿病足潰瘍(diabetic foot ulcer, DFU)創面遷延難愈，致殘率、致死率高，給社會經濟帶來沉重負擔[1, 2]。糖尿病足潰瘍分為3型，即神經型、缺血型和神經-缺血型。隨著糖尿病的發展，最終導致全身微循環障礙而致使并發癥發生，包括糖尿病酮癥酸中毒、糖尿病腎病、糖尿病性心血管病、糖尿病視網膜病變、糖尿病周圍神經病變、糖尿病足等[3]。25%的糖尿病患者會發生糖尿病足潰瘍，而糖尿病足潰瘍會顯著增加截肢風險和病死率，其中神經型患者的5年病死率高于霍奇金淋巴瘤、乳腺癌和前列腺癌，神經-缺血型患者的5年病死率高于大腸癌[4]。2007～2017年全國范圍內1型糖尿病的發生率雖然仍處于較低水平，但呈現上升趨勢。2021年，我國1型糖尿病新發人數中0～19歲為0.61萬人。然而，1型糖尿病在中國的認知度和關注度仍然較低，其發生率被低估，相關研究較少，因此探索1型糖尿病及其并發癥具有重要意義[5, 6]。

中性粒細胞是血液循環中首先遷移到炎癥部位的免疫細胞，通過吞噬、脫顆粒作用，在細胞因子的產生、中性粒細胞胞外誘捕網(neutrophil extracellular traps, NETs)的釋放、病原體的捕獲和消除等固有免疫方面、適應性免疫方面以及防御功能方面發揮著重要的作用[7]。中性粒細胞被激活后，可形成鑲嵌著組蛋白、中性粒細胞彈性蛋白酶(neutrophil elastase, NE)、髓過氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)、組織蛋白酶G等殺菌蛋白的DNA網狀結構NETs。研究發現，糖尿病足潰瘍患者創面有大量NETs存在，而過多或持續存在的NETs可導致糖尿病創面愈合遲緩[8, 9]。糖尿病患者的血清中瓜氨酸化組蛋白H3(citrulline histone 3, Cit-H3)、游離的雙鏈DNA和NE的表達均顯著升高[8]。

佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)是體外刺激中性粒細胞產生NETs的經典誘導劑，其通過作用于蛋白激酶 C(PKC)，激活 Raf/MEK/ERK 信號通路及煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸氧化酶(NADPH oxidase，NOX2)，進而誘導 ROS 的產生，之后核心組蛋白H3/H4在肽酰基精氨酸脫亞胺酶4(peptidyl arginine deiminase 4, PAD4)的作用下發生瓜氨酸化，形成Cit-H3促使中性粒細胞核內染色體的解聚，隨后胞核形態改變，核膜破裂生成NETs，并釋放NE和MPO，這個過程被稱為NETosis[10,11]。其中，Cit-H3是NETs最特異性的循環標志物[12]。

中性粒細胞是在骨髓中由造血干細胞分化而來的。雖然PMA誘導NETosis的機制已經比較清晰，但糖尿病動物模型中骨髓來源的中性粒細胞進行NETosis體外誘導的研究報道較少。因此本研究采用鏈脲佐菌素 (streptozocin，STZ)誘導1型糖尿病小鼠，通過動態觀察不同濃度的PMA誘導糖尿病小鼠骨髓來源中性粒細胞NETs形成的影響，并分析NETs結構及組分，建立1型糖尿病小鼠體外NETs模型和檢測方法，為研究糖尿病足潰瘍NETs產生和調節機制奠定方法學基礎。

材料與方法

1.實驗材料:小鼠骨髓來源中性粒細胞分離試劑盒(貨號：TBD2013NM)購自天津灝洋生物制品科技有限責任公司。高糖DMEM(5.5mmol/L,貨號：11965092)、胎牛血清(貨號：10100154)和核酸染料Sytox Green(貨號：2204228)購自美國Thermo Fisher公司。PMA(貨號：SLBX8889)購自美國Sigma公司。ROS探針DCFH-DA(貨號：S0033S)和Alex Fluor?488(貨號：A0423)標記山羊抗兔抗體購自中國上海碧云天生物技術研究所；兔抗鼠瓜氨酸化組蛋白H3(貨號：ab5103)抗體購自英國Abcam公司；血糖儀及試紙(貨號：479771)購自美國強生公司；鏈脲佐菌素(貨號：S8050)、8mm細胞爬片(貨號：YA0353)購自中國Solarbio公司；激光共聚焦(型號：蔡司LSM780)購自德國Zeiss公司；掃描電子顯微鏡(型號：S-3400)購自日本Hitachi日立公司。SPF級6～8周健康雄性 C57BL/6J小鼠20只，由斯貝福北京生物技術有限公司提供，體質量為22g左右; 室溫22℃、濕度50%～60%、12h明暗交替，適應性飼養1周。動物生產許可證號：SCXK(京)2019-0010。

2.1型糖尿病小鼠模型制備：20只小鼠造模前禁食12h，避光環境中，腹腔注射由檸檬酸鹽緩沖液(0.1mol/L，pH4.5) 配置的 0.1% STZ(40mg/kg)，注射2h后進食，連續注射5天；注射結束1周后，隔天尾靜脈采血檢測隨機血糖，血糖值>16.6mmol/L，則糖尿病小鼠模型造模成功[13]。

3.糖尿病小鼠骨髓來源中性粒細胞的分離：在無菌條件下，體外剝離糖尿病小鼠股骨和脛骨，勻漿沖洗液沖洗內腔中的骨髓，70μm細胞篩網過濾，450×g，離心10min，棄上清；紅細胞沉降液重懸細胞；于離心管中依次加入3ml的中性粒細胞分離液與1.5ml的80%濃度中性粒細胞分離液；吸取1ml細胞懸液樣本加于80%濃度中性粒細胞分離液液面上，750×g，離心30min。吸取下層白色環狀中性粒細胞層，清洗，400×g，離心10min，棄上清，加入紅細胞裂解液；細胞重懸于含10%胎牛血清的DMEM完全培養液，計數備用。

4.PMA體外誘導中性粒細胞NETs形成：用DMEM完全培養基重懸中性粒細胞，接種于激光共聚焦小皿中，在37℃、5% CO2培養箱中培養1h，分別加入PMA(0、100、200、400nmol/L)，培養2.5h后加入Sytox Green染料(0.4μmol/L)，激光共聚焦顯微鏡下動態觀察3～7h。

5.熒光免疫組化法檢測Cit-H3：中性粒細胞接種于激光共聚焦小皿中，PMA刺激6h后，加入4%多聚甲醛，室溫固定20min；PBS洗；用含0.5% Triton X-100的PBS透化1min；PBS洗；滴加5% FBS的封閉緩沖液，37℃孵育1min；加入兔源抗-H3Cit抗體(1∶250)，4℃孵育過夜；PBS洗；加入羊抗兔Alex Fluor?488(1∶600)，37℃孵育1h；PBS洗，加入DAPI(1∶2000)避光染色5～10min，激光共聚焦顯微鏡觀察。

6.細胞活性氧(ROS)檢測：熒光分光光度計法：中性粒細胞接種于6孔板(2×106/ml)，5%CO2、37℃培養1h；加入PMA(100nmol/L)培養6h；800r/min，離心5min，棄上清；陽性對照組加入1ml ROSUP(50mg/ml)培養30min，800r/min，離心5min，棄上清；細胞收集后，重懸于1ml的DCFH-DA探針(1∶1000)中培養20min；洗滌，重懸細胞并接種于96孔板中，采用分光光度計法使用熒光酶標儀檢測485nm/530nm熒光值。熒光免疫組化法：中性粒細胞接種于激光共聚焦小皿中，PMA刺激6h后，加入DCFH-DA探針(1∶1000)，孵育30min； 4%多聚甲醛固定；PBS洗，加入DAPI(1∶2000)避光染色5～10min，激光共聚焦顯微鏡觀察。

7.掃描電子顯微鏡(SEM)下觀察NETs形成：將加入PMA的小鼠骨髓來源中性粒細胞(2×106/ml)接種于TC處理的細胞爬片上，5%CO2、37℃培養6h，4.0%戊二醛固定。吸除培養液，PBS洗，2.5%戊二醛(pH 7.2～7.4) 4℃固定，PBS洗， 1%鋨酸固定1h， PBS 洗，梯度乙醇脫水(30%、50%、70%、80%、90%、100%，5分鐘/次)，CO2臨界點干燥，真空噴鍍，掃描電子顯微鏡下觀察。

8.統計學方法：所有結果均來自于3次以上重復實驗，應用 SPSS 20.0統計學軟件對數據進行統計分析，GraphPad Prism 6.0軟件作圖，結果采用配對t檢驗或單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.中性粒細胞的分離純度鑒定：中性粒細胞分離后涂布于載玻片上，待干片后進行快速吉姆薩染色，顯微鏡下觀察并拍照。光學顯微鏡下見大量中性粒細胞，中性粒細胞呈現馬蹄形或分葉狀的細胞核，核的顏色為藍紫色，可見淡紫色的中性粒細胞質，計數不同視野中中性粒細胞數量，統計分析其純度達到85%以上(圖1)。

圖1 小鼠骨髓來源的中性粒細胞快速吉姆薩染色(×40)

2.PMA誘導糖尿病小鼠中性粒細胞形成DNA網狀結構：通過激光共聚焦顯微鏡檢測NETs形成：PMA處理后(100、200、400nmol/L)5h時可見綠色絲狀或團狀結構；6h時網狀結構明顯增多；刺激7h時，各組熒光開始減弱。與0nmol/L PMA比較，100nmol/L PMA刺激中性粒細胞6h時，網狀結構生成顯著增多，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01,圖2)。

圖2 PMA誘導中性粒細胞胞外DNA含量變化A.動態觀察(熒光免疫組化法染色，×400)；B.Sytox Green 染色后用ImageJ軟件定量分析6h時NETs*P<0.05，**P<0.01，n=3

3.PMA增強NETs結構組分Cit-H3水平：與200nmol/L、400nmol/L PMA比較，100nmol/L PMA刺激中性粒細胞6h時，網狀結構生成顯著增多，因此后續實驗選用100nmol/L作為PMA誘導NETs的適宜濃度，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01,圖2)。100nmol/L PMA綠色熒光明顯增多(圖3A)，提示PMA刺激中性粒細胞，顯著上調了Cit-H3表達水平，差異有統計學意義(P<0.05,圖3B)。

圖3 PMA誘導中性粒細胞6h時Cit-H3(綠色)表達A.免疫熒光法：Cit-H3為綠色，胞核為藍色(熒光免疫組化法染色，×400)；B.ImageJ軟件定量分析Cit-H3(n=3)

4.PMA誘導中性粒細胞活性氧(ROS)升高：100nmol/L PMA糖尿病小鼠骨髓中性粒細胞ROS生成顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05，圖4)。

圖4 PMA誘導中性粒細胞6h時ROS生成A.免疫熒光法：ROS為綠色，胞核為藍色(熒光免疫組化法染色，×630)；B.ImageJ軟件定量分析ROS；C.熒光分光光度計法(n=3)

5.掃描電鏡觀察PMA誘導中性粒細胞出現NETs網狀結構：0nmol/L PMA中性粒細胞表現出完整的正常細胞形態，無明顯網狀結構；而PMA處理組中性粒細胞變得扁平，形成膜突起或包膜破裂，從而形成粗細不一的纖維束狀的網狀結構(圖5)。

圖5 各組掃描電鏡下NETs結構(×4000)A.0nmol/L PMA;B.100nmol/L PMA

討 論

周圍神經病變、周圍動脈疾病、足部畸形、創傷與感染等是導致糖尿病足潰瘍的關鍵因素[14]。糖尿病足潰瘍的傳統治療方法如清創、抗感染與血運重建臨床效果有限，而臨床上新型治療方法如物理療法(激光、局部負壓吸引、高壓氧療、藥物離子導入等)、生物治療(富集血小板和血小板衍生的生長因子療法)、新型敷料(高分子合成敷料和人造生物敷料)、人皮膚移植、組織工程皮膚、干細胞療法等取得了一定的臨床療效，但存在纖維化、不穩定性、免疫排斥、感染性、致癌性等安全性問題，整體費用高，易復發，給患者帶來沉重的經濟負擔與精神壓力[15]。研究發現，DPI(NOX2的強效抑制劑)、PAD4 抑制劑、脫氧核糖核酸酶Ⅰ (deoxyribonuclease Ⅰ，DNase Ⅰ)等NETs抑制劑處理可以有效阻止糖尿病患者和小鼠的中性粒細胞生成NETs[16, 17]。敲除PAD4的糖尿病小鼠創面NETs生成減少，創面愈合加快[8,18]。此外，硫化氫可通過抑制ROS介導的MAPK/ERK1/2和p38的激活來抑制NETosis形成，從而促進糖尿病傷口愈合[19]。提示抑制NETs生成可以顯著改善糖尿病患者或糖尿病小鼠的創面愈合，為以NETs為靶點的糖尿病足潰瘍治療提供新的思路[11]。而糖尿病動物模型中性粒細胞的NETosis誘導可提供方法學基礎。

目前常用的糖尿病小鼠模型有STZ誘導的1型、2型糖尿病小鼠(大鼠)或db/db小鼠。STZ對一定種屬動物的胰島β細胞有選擇性破壞作用，能誘發動物發生糖尿病。1型糖尿病與2型糖尿病動物模型的制備與STZ注射的劑量有關系，大劑量注射時，由于直接引起胰島β細胞的廣泛破壞，可造成1型糖尿病模型。因此，STZ可建立一種簡單、經濟、穩定可靠同時病理表現與人類糖尿病類似的動物模型[20,21]。db/db小鼠是4號染色體的瘦素(leptin)受體基因缺陷導致的糖尿病小鼠。由于db/db小鼠不存在人為誘導因素的干擾，糖尿病的產生與臨床患者更為相似，目前被認為是較理想的2型糖尿病研究用動物模型，但是價格昂貴[22,23]。STZ誘導的糖尿病小鼠和db/db小鼠創面Cit-H3表達升高，創面愈合延遲[8]。db/db小鼠創面造模后第15天，PAD4、NE、Cit-H3、MPO表達和游離DNA含量顯著升高[19]。糖尿病小鼠很好地體現了糖尿病患者在NETosis易感性方面的病理特征，可用于NETs相關實驗的研究。然而，糖尿病動物模型體內NETs誘導研究較普遍，但混雜因素眾多，并不能明確NETs及其各組分的升高受某種具體因素(血糖、感染、細胞間相互作用等)的影響。因此，體外NETs的誘導研究尤為重要，本研究選用STZ誘導的1型糖尿病小鼠骨髓來源的中性粒細胞來建立體外NETs模型。

分離純化中性粒細胞最常見的方法有免疫磁珠法和密度梯度離心法。免疫磁珠法分離細胞純度高，操作簡便、高效，國外應用較廣泛且深受肯定，雖然價格昂貴，可作為常規分離純化中性粒細胞的首選方法。用于NETs研究所分離的中性粒細胞要選用非活化磁珠分選試劑，以免操作過程中中性粒細胞被活化生成NETs。因此，本實驗采用密度梯度離心法分離純化中性粒細胞，該方法操作簡便，成本低，細胞分離時間短，對細胞無明顯毒性和刺激性，吉姆薩(Giemsa)染色后顯微鏡下觀察分析中性粒細胞純度可達90%。

刺激中性粒細胞釋放NETs 的刺激因素包括多種病原體，如PMA、脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)和鈣離子載體(A23187)等[24, 25]。對于STZ誘導的糖尿病小鼠和db/db小鼠的外周血中性粒細胞，LPS(25g/ml)刺激2.5h，Cit-H3表達、PAD4活性和NETs含量升高[8]。對于STZ誘導的糖尿病SD大鼠腹腔中性粒細胞，PMA(100nmol/L)刺激3～5h時NETs形成[26]。與PMA和鈣離子載體A23187比較，LPS是一種更具生物學相關性的NETosis刺激物，但其誘導能力不穩定，需高濃度才具有良好誘導能力[25]。NETs的體外誘導物如LPS或IL-8等細胞因子存在價格昂貴、獲取不易、誘導濃度高、時間長、效果不穩定等問題。因此，本研究選用NETs的經典誘導劑PMA，成功在較高誘導濃度(100nmol/L)與較長誘導時間(6h)下刺激1型糖尿病小鼠骨髓來源中性粒細胞產生顯著性NETs。

本實驗結果表明，PMA誘導1型糖尿病小鼠骨髓來源中性粒細胞NETs形成，100nmol/L PMA 6h時，NETs顯著增多，并顯著促進了Cit-H3表達與ROS釋放。既往報道PMA(100nmol/L)刺激STZ誘導的糖尿病SD大鼠腹腔中性粒細胞3～5h時NETs形成，筆者使用PMA的刺激濃度和時間基本一致。顯微鏡下NETs結構與成分組成鑒定是評估NETs的重要標準，NETs具有獨特的超微結構，其主要成分是直徑為15～17nm的DNA纖維和直徑為25～50nm的球形蛋白質結構域構成的可達50nm的三維網狀結構[27]。本實驗在激光共聚焦顯微鏡和掃描電鏡下均可見PMA刺激后形成NETs網狀結構。

綜上所述，調控NETs生成是治療糖尿病足潰瘍的重要研究靶點，本研究建立了PMA誘導的1型糖尿病小鼠體外NETs模型，該模型中NETs的體外誘導與Raf-MEK-ERK信號通路的相關性需進一步驗證。在糖尿病足潰瘍復雜病理條件下，中醫藥在糖尿病足潰瘍中NETs產生和調節機制的探索是筆者課題組后期體外研究的主要方向，這將為實現對NETs形成精細調控與新的治療策略提供理論依據。