慢性乙型肝炎患者外周血SOCS3 mRNA的表達及其與Th17的關系

趙寅洲，張茹薏，趙家潔，李敏玥，宋 瑞，游 晶

(1. 昆明醫科大學第一附屬醫院感染性疾病和肝病科 國家衛生健康委員會毒品依賴和戒治重點實驗室，云南 昆明 650032； 2. 云南省第一人民醫院感染性疾病科與肝病科，云南 昆明 650034)

我國乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染人群數量龐大，為全球乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitis B surface antigen, HBsAg)陽性人數最多的國家，有慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)患者2 000萬～3 000萬[1]。HBV感染慢性化的發病機制至今仍未闡釋清楚，其中CD4+T淋巴細胞的分化和功能障礙可能是導致機體免疫對HBV清除障礙的主要原因之一[2]。輔助性T細胞17(helper T cell 17, Th17)和調節性T細胞(regulatory T cell, Treg)是CD4+T淋巴細胞的兩個亞群，大多數研究[3-4]顯示在慢性HBV感染過程存在Th17/Treg失衡，并且主要以Th17升高為主，而Th17及其效應分子白細胞介素(interleukin，IL)-17A、IL-23的高表達可能促進肝臟炎癥的發生發展，并與肝纖維化進展密切相關。其中維甲酸相關孤兒核受體γt(retinoid-related orphan nuclear receptor gammat, RORγt)是Th17主要的轉錄因子，在Th17分化和發育過程中都起著關鍵的作用，而細胞因子信號轉導抑制因子3(suppressor of cytokine signaling 3, SOCS3)是JAK/STAT信號通路經典的負反饋抑制因子，JAK/STAT信號通路在調節RORγt的表達中發揮著重要的作用[5-6]。本文主要通過研究CHB患者SOCS3 mRNA表達情況，探索其與Th17的關系，從而尋找可能影響CHB患者Th17異常表達的因素。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2021年2—8月于昆明醫科大學第一附屬醫院門診就診的CHB患者30例及同期至該院門診的15例正常體檢人員為對照組。研究對象同意入組研究后，收集患者血標本和臨床資料。本研究符合《赫爾辛基宣言》的倫理標準，并經昆明醫科大學第一附屬醫院倫理委員會討論通過，所有入組對象均知情同意。

1.2 納入與排除標準 所有CHB患者均符合以下標準：(1)納入標準(需滿足以下所有條件)：①符合《慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)》[2]對于CHB的診斷標準；②既往HBsAg陽性>6個月，且既往或目前存在肝功能異常或肝影像學異常情況；③入組前至少半年以上未行核苷(酸)類似物、干擾素等抗病毒藥物治療。(2)排除標準(符合以下任一條件)：①由藥物、毒物及其他原因導致的慢性肝炎；②合并甲型、丙型、丁型、戊型等嗜肝病毒及其他非嗜肝病毒感染；③合并重度脂肪肝、酒精性脂肪肝、自生免疫性肝病及終末期肝病，如肝硬化、肝癌等其他肝病；④合并自身免疫性疾病、免疫缺陷性疾病及其他嚴重基礎疾病所致的肝損傷；⑤不明原因的肝損傷；⑥妊娠期婦女。正常對照組符合以下條件：①HBsAg、乙型肝炎病毒e抗原(hepatitis Be antigen，HBeAg)陰性，乙型肝炎病毒表面抗體(hepatitis B surface antibody，HBsAb)陽性或陰性，肝功能正常；②無高血壓、糖尿病、冠心病、腦梗死等基礎疾病史；③無自身免疫性疾病、各種急慢性肝病及各種腫瘤性疾病史；④近期無各種急慢性感染性疾病史；⑤近期未使用過任何免疫相關藥物。

1.3 研究方法 采集所有入組研究對象清晨、空腹時靜脈血約9 mL，其中采用EDTA抗凝管的血標本2支，1支血標本立即用于流式細胞術檢測外周血Th17和Treg細胞頻數，1支血標本送至實驗室，備4只新的1.5 mL EP管，每支EP管中加入200 μL新鮮血和800 μL裂解液后立即吹打混勻，貯存于-80℃冰箱中，待收集完標本后全用于提取外周血RNA；采用不含抗凝劑管的血標本1支，室溫孵育20 min，然后4℃ 3 000 rpm離心15 min后立即分裝上清(血清)，并于-80℃條件下保存用于后續細胞因子表達水平檢測。

1.3.1 主要的試劑和儀器 (1)流式細胞術主要實驗試劑：人外周血淋巴細胞分離液購自TBD公司，RPMI 1640 medium、胎牛血清(FCS)購自美國Gibco公司，佛波酯PMA 50ng/mL購自北京索萊寶科技有限公司，高爾基體阻斷劑2 μmol/mL、Stain Buffer緩沖液購自美國BD公司，Cytofix/Cytoperm固定/破膜緩沖試劑盒(包括Fixation/Permeabilization solution、BD Perm/Wash Buffer 10×)、PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD4抗體、PE Mouse anti-Human IL-17A抗體、同型對照抗體購自美國Biolegend公司。酶聯免疫吸附試驗(ELISA)主要實驗試劑：人IL-17/IL-17A ELISA試劑盒(EHC170)、人IL-23 ELISA試劑盒(EHC171)購自深圳欣博盛生物科技有限公司。qRT-PCR實驗主要實驗試劑：SureScript-First-strand-cDNA-synthesis-kit、BlazeTaqTMSYBR?Green qPCR Mix 2.0購自GeneCopoeia，Nuclezol LS RNA Isolation Reagent購自ABP Biosciences Inc，引物購自擎科生物，無RNase水購自Biteke Gorporation，DL2000 DNA Marker購自Takara，核酸染料購自北京百泰克生物技術有限公司。(2)主要實驗儀器：Attune?NxT聲波聚焦流式細胞儀，5% CO2溫箱購自CRYSTAL 精騏，低溫高速冷凍離心機購自安徽中科中佳科學儀器有限公司；酶標儀(ELX800)購自美國BioTek，隔水式恒溫培養箱(GHP-9050N)購自上海一恒科學儀器有限公司；紫外分光光度計(752)購自上海菁華科技儀器有限公司，核酸電泳裝置、紫外觀察箱購自北京市六一儀器廠，2720 Thermal Cycler 普通PCR儀購自Applied Biosystems，CFX96實時定量熒光PCR儀購自Bio-Rad，96孔定量PCR板購自ABI(4346906)，凝膠成像系統QuickGel 6100購自Monad，冷凍高速離心機購自Thermo公司。

1.3.2 外周血Th17細胞頻數的檢測 采用密度梯度離心法分離獲得外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)，將上述分離到的PBMC稀釋為1×106個/mL的PBMC懸液。取1 mL上述PBMC懸液加入3 mL RPMI 1640完全培養基中，在37℃ 5% CO2孵箱培育過夜，時間不少于12 h；向上述培育過夜的混合液體中加入1 mL細胞刺激劑孵育5 h。加入5 μL表面抗體PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD4進行細胞外抗體標記染色；加入300 μL 1×Cytofix/Cytoperm固定破膜劑破膜后，加入5 μL胞內抗體PE Mouse anti-Human IL-17A進行細胞內抗體標記染色(具體嚴格按照操作說明進行)。4℃，1 300 rpm離心5 min，棄上清后渦旋，加350 μL預冷的staining buffer緩沖液上流式儀檢測，用Flowjo-v10流式細胞分析軟件進行分析。本試驗結果描述的Th17細胞頻數即Th17細胞絕對計數。

1.3.3 血清IL-17A和IL-23表達水平的檢測 本試驗采用ELISA雙抗體夾心法測定細胞因子IL-17A和IL-23表達水平，具體操作均嚴格按照相應說明書進行。

1.3.4 外周血SOCS3、RORγt mRNA表達水平的檢測 (1)采用一步法提取外周血總RNA，電泳檢測完整性，分光光度儀檢測RNA純度和濃度。(2)RT-PCR：按照下列順序依次加入各個試劑和溶液進行逆轉錄體系的配置，見表1。配置完成后短暫離心，在普通PCR儀上按照如下條件逆轉錄：第一步：25℃，5 min；第二步：42℃，45 min；第三步：85℃，5 min；第四步：4℃，hold。(3)qRT-PCR反應：使用廣州Genecopoeia公司的BlazeTaqTMSYBR?Green qPCR Mix 2.0試劑盒，每個樣本設3個復孔，以SOCS3、RORγt mRNA作為目的基因，GAPDH作為內參基因進行qRT-PCR檢測。引物的合成由擎科生物公司完成，引物序列見表2。先將上述逆轉錄產物cDNA稀釋5倍，所有樣品必須按照同一倍數進行稀釋，再進行下述qPCR反應。qPCR擴增反應體系的配置見表3。上述反應體系配置好后短暫離心，按95℃預變性30 s，95℃變性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸30 s條件在CFX96實時定量熒光PCR儀進行40個循環的反應。擴增完成后，從起始溫度60℃開始緩慢加熱到最終溫度95℃反應10 s得到qPCR反應產物的熔解曲線。反應結束后確認擴增曲線及熔解曲線，讀取Ct值。(4)結果分析：用2-△△Ct法計算基因的相對表達量，△Ct=Ct(目的基因)-Ct(內參基因)；△△Ct=△Ct(試驗組)-△Ct(對照組)；最后計算2-△△Ct值。

表1 逆轉錄體系配置

表2 SOCS3、RORγt和GAPDH基因特異性引物序列(5’→3’)

表3 qPCR擴增反應體系

2 結果

2.1 一般情況 兩組患者組內男、女比例及年齡大小比較，差異無統計學意義(均P>0.05)。CHB患者肝功能指標丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase, ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase, AST)水平均較對照組高，差異有統計學意義(均P<0.05)。CHB患者病毒指標分析等見表4。

表4 兩組患者一般資料、肝功能指標及病毒指標比較

2.2 Th17細胞頻數及其效應分子IL-17A和IL-23表達水平分析 試驗結果顯示CHB組患者Th17細胞頻數、IL-17A和IL-23表達水平均高于對照組，差異均有統計學意義(均P<0.05)。見表5。

表5 兩組Th17細胞頻數及其效應分子表達水平比較

2.3 外周血SOCS3、RORγt mRNA表達水平分析 試驗結果顯示，CHB患者外周血SOCS3、RORγt mRNA表達水平高于對照組，差異均有統計學意義(Z值分別為-3.074、-2.765，均P<0.05)。見圖1。

注：紅線代表中位數和95%置信區間[M(95%CI)]。

2.4 相關性分析 與HBV DNA水平(用HBV DNA定量數據表示)進行Spearman秩相關性分析，均選取在檢測儀器檢測范圍內的患者，即HBV DNA定量為(1×101～1×108) IU/mL。

2.4.1 CHB患者HBV DNA水平與患者其他指標相關性分析 相關性分析結果顯示，CHB患者HBV DNA水平與Th17細胞頻數、IL-17A表達水平以及SOCS3、RORγt mRNA表達水平之間存在正相關(r值分別為0.570、0.563、0.662、0.561，均P<0.05)，而與IL-23表達水平、ALT和AST水平無相關關系(均P>0.05)。見圖2。

圖2 CHB患者HBV DNA水平與其他指標散點圖(n=22)

2.4.2 CHB患者SOCS3 mRNA表達水平與其他指標相關性分析 分析結果顯示，CHB患者SOCS3 mRNA表達水平與Th17細胞頻數、IL-17A、RORγt mRNA表達水平存在正相關(r值分別為0.626、0.826、0.552，均P<0.05)，而與IL-23、肝功能指標無相關關系(均P>0.05)。見圖3。

圖3 CHB患者SOCS3 mRNA表達水平與Th17細胞頻數、IL-17A、RORγt mRNA表達水平散點圖(n=30)

3 討論

目前，國內外大量研究[7-8]證實，CHB患者存在Th17/Treg失衡，而且該平衡主要以Th17升高為主，Th17/Treg失衡還可預示肝纖維化進程。本研究主要通過細胞水平、轉錄水平尋找可能影響CHB患者Th17升高的因素，結果發現CHB患者外周血Th17細胞頻數、IL-17A和IL-23表達水平均明顯升高，并且Th17及其效應分子IL-17A與HBV病毒載量之間均存在正相關。

國內研究[9-11]顯示，在CHB患者外周血單個核細胞中Th17及其效應分子IL-17A表達水平升高，其升高可能促進了HSCs的活化，進一步加重肝纖維化程度。肝臟中Th17多集中在肝纖維化較嚴重的區域，Th17數量與反映肝纖維化程度的血清學標志物呈正相關[12]。因此，推測IL-17A、IL-23可能是Th17在慢性HBV感染過程中發揮免疫功能的主要效應分子之一。研究[13-14]證實，IL-17A能通過誘導中性粒細胞的募集來促進肝臟炎癥的發生發展，而HSCs細胞膜表面可高表達IL-17受體(IL-17 receptor, IL-17R)，IL-17A也可刺激肝臟庫普弗細胞(Kupffer cells, KCs)分泌細胞因子IL-6、IL-1β、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)和TGF-β1，進一步激活HSCs，加重肝細胞炎癥及纖維化程度。

本研究進一步分析了CHB患者外周血SOCSC3 mRNA表達水平與病毒載量、Th17及其效應分子和特征性轉錄因子的關系，結果顯示CHB患者外周血SOCS3、RORγt mRNA高表達，SOCS3 mRNA表達水平與Th17細胞頻數、IL-17A和RORγt mRNA表達水平均呈正相關。研究[6]發現，SOCS3在胸腺T細胞的正常分化及T輔助細胞的極化過程中起著重要的調節作用，SOCS3主要通過調節IL-23/STAT3信號通路影響Th17的分化和成熟。在動物試驗中發現[15]，M1巨噬細胞相關的SOCS3在炎癥反應中起到了正性調節的作用，對于某些促炎因子的產生發揮積極的作用，推測SOCS3可能通過基因特異性方式調節促炎介質的表達；并且該研究還發現選擇性沉默SOCS3基因的巨噬細胞驅動T效應細胞分化的潛力下降，尤其對Th17分化影響更大。而國內有關干擾素抗病毒治療效果的研究[16-17]顯示，CHB患者接受干擾素抗病毒治療后無應答組患者外周血PBMC及肝組織中SOCS3 mRNA表達量明顯升高，而在應答組SOCS3 mRNA表達量則明顯下降，推測SOCS3 mRNA可能會影響干擾素抗病毒效果。因此，推測在慢性HBV感染過程中HBV DNA水平的升高可能通過某些機制促進了SOCS3 mRNA的表達，SOCS3 mRNA的異常升高可能通過調節RORγt mRNA的表達從而影響Th17的分化和功能，并進一步影響慢性HBV感染過程中Th17/Treg的平衡狀態。

綜上所述，目前慢性HBV感染的免疫機制仍有待進一步闡述，而大多數研究發現CHB患者中存在Th17高表達的狀況。本研究通過探索CHB患者外周血SOCS3 mRNA的表達與Th17的關系，發現SOCS3 mRNA在CHB患者外周血中異常高表達，并與Th17細胞頻數存在正相關關系，推測SOCS3 mRNA異常表達可能通過調節RORγt mRNA的表達來影響CHB患者Th17的分化及其效應分子的分泌，也為進一步研究CHB患者中Th17異常高表達的機制提供了新的思路，并為尋找恢復慢性HBV感染中Th17/Treg平衡的治療手段提供一定的思路，也是后續進一步研究的方向。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。