肉雞養殖場環境水體中沙門菌的耐藥性與噬菌體的抑菌作用

張 佳 ， 李情園 ， 董藝博 ， 馬翮斯 ， 章興賾 ， 陳佳鑫 ， 高建帥 ， 苑方重

(河北農業大學動物醫學院/中獸醫學院 ， 河北 保定 071001)

目前，在畜牧養殖業中由于抗生素的頻繁使用與不合理利用，導致沙門菌的耐藥性日益突出，而耐藥沙門菌的嚴重擴散已經成為影響畜牧業與危害人類公共安全的重要問題[1-2]。在肉雞養殖過程中，致病性沙門菌多重耐藥問題更加嚴重[3-4]。通常情況下，養殖場內的耐藥沙門菌可以通過污染的水體與土壤快速擴散進入環境中并長時間存在[4]。本試驗通過分離純化宿主為耐藥沙門菌的噬菌體，尋求消除沙門菌耐藥性的可能途徑，為臨床治療與防治耐藥沙門菌問題提供可能的方法。

1 材料與方法

1.1 細菌分離與鑒定 腸炎沙門菌標準株ATCC14028，由青島綠谷商貿有限公司提供。試驗中分離的耐藥沙門菌株，來自5份水樣，采集自河北省保定市易縣某肉雞養殖場周圍池塘表層水體。將水樣靜置1 h，讓水樣自然沉淀，取上層清樣10 μL，加入10 mL的RV肉湯中進行增菌培養，于37 ℃培養24 h，取菌液劃線接種在SS瓊脂培養基上，37 ℃培養24 h。取中心黑色的光滑圓形單個菌落，分別劃線接種在SS、MacConkey和HE培養基上，37 ℃培養24 h。取SS培養基上生長特征類似沙門菌的菌株，進行生化試驗鑒定，根據結果選擇符合沙門菌特征的菌株11株，進行革蘭染色觀察并保存備用。

為進一步鑒定11株沙門菌，提取其DNA進行PCR擴增，擴增目的片段為腸炎沙門菌特異性DNA標記SdfⅠ，預計擴增片段長度約為333 bp，引物設計參考Tennant等[5]的報道，上游引物：5′-TGTGTTTTATCTGATGCAAGAGG-3′；下游引物：5′-CGTTCTTCTGGTACTTACGATGAC-3′。將本試驗分離的沙門菌株分別編號，按順序暫定編號為Sal-1、Sal-2…Sal-11。

1.2 噬菌體分離增殖與計數 準備SM緩沖液：NaCl 5.8 g，MgSO4·7H2O 2 g，Tris 6 g，2%明膠5 mL，加雙蒸水800 mL溶解，調節至pH=7.5，加雙蒸水定容至1 L，經高壓滅菌后室溫放置備用。

廢水中噬菌體的分離與純化采用Luis等[6]報道的方法，并略做調整。將分離細菌的同一批水樣，于4 ℃、6 100 r/min離心10 min，取上清液使用0.22 μm 細菌濾器過濾，濾液于4 ℃保存備用。取100 μL上述濾液，加入1 mL預培養的沙門菌液體培養基中，與3 mL預熱的上層培養基(含0.4%瓊脂)混合，然后均勻覆蓋在SS平板培養基上，37 ℃培養24 h。檢查噬菌體在細菌培養基上形成的噬菌斑，挑取形狀清晰的噬菌斑，混溶入SM緩沖液中；上述過程重復3次，然后將噬菌體液于4 ℃保存備用。

噬菌體計數方法采用Abiyad等[7]報道的方法。取噬菌體保存液，使用SM緩沖液10倍梯度稀釋，形成10-1～10-8濃度梯度，每個稀釋梯度取10 μL分別點在沙門菌上層培養基上，37 ℃培養24 h，計數培養基上各梯度濃度的噬菌體斑，若噬菌體生長密度大，則選擇下一濃度梯度計數。

1.3 沙門菌株藥敏試驗 準備藥敏紙片，包括氨芐西林(AMP)、氧氟沙星(OFX)、阿莫西林(AMX)、頭孢噻肟(CTX)、恩諾沙星(ENR)、氟苯尼考(FFC)、左氧氟沙星(LEV)、鏈霉素(S)、林可-壯觀霉素(LS)和磺胺異噁唑(SF)等。將分離的各株沙門菌和標準株菌液各1 mL，與3 mL預熱的上層培養基(含0.4%瓊脂)混合，然后均勻覆蓋在SS平板培養基上，待上層培養基凝固后，將選取的藥敏紙片輕貼在培養基表面，37 ℃培養24 h，測量抑菌環直徑，按照美國臨床實驗室標準化協會(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)標準(m100-s20)判斷藥物敏感性：抑菌環直徑(φ)≥18 mm為敏感(S)，φ≤14 mm為耐藥(R)。

1.4 噬菌體感染復數(Multiplicity of infection,MOI)與細菌生長曲線 將營養瓊脂NA(成分：蛋白胨10 g，牛肉粉3 g，氯化鈉5 g，瓊脂15 g，pH 7.4，加水至1 L)高壓滅菌，冷卻至60 ℃左右，加入96孔細胞培養板，每孔加瓊脂100 μL，冷凝后備用。

根據藥敏試驗結果，選擇多重耐藥菌株Sal-4進行噬菌體抑菌試驗。將噬菌體加入過夜培養的Sal-4菌液中，并分別稀釋成不同濃度，使最終MOI為10∶1、1∶1、1∶10、1∶100，分別取10 μL細菌與噬菌體的混合液加入96孔板瓊脂培養基上，37 ℃靜置培養，使用酶標儀測量各孔OD值，每隔6 h測量1次，連續24 h。

1.5 噬菌體對沙門菌耐藥性的影響 根據噬菌體計數與MOI選擇結果，將噬菌體稀釋，加入1 mL 過夜培養的Sal-4菌液中，使最終MOI為1∶10，重復1.3藥敏試驗，并測量抑菌環直徑。判定方法同1.3。

1.6 動物試驗 將1.2純化分離的噬菌體稀釋至濃度為1×108噬菌斑形成單位(Plaques forming unit,PFU)備用。將40只21日齡小鼠隨機分為4個組，每組10只，選擇沙門菌Sal-4作為試驗感染菌株，具體分組和處理見表1。

表1 試驗分組和處理Table 1 Experimental groups and treatments(n=10)

2 結果

2.1 細菌分離和鑒定 本試驗成功分離出沙門菌11株，按順序分別編號，暫定編號為Sal-1～Sal-11。針對生化試驗初步鑒定的11株沙門菌，進行SdfⅠ基因PCR擴增，所有菌株均獲得了明亮的DNA條帶，片段長度約為333 bp，部分沙門菌分離株的凝膠電泳結果見圖1。

圖1 部分腸炎沙門菌分離株Sdf Ⅰ基因的PCR擴增Fig.1 PCR amplification of Sdf Ⅰ gene in some Salmonella enteritis isolatesM：DL-2 000 DNA相對分子質量標準； 1：沙門菌標準株ATCC14028； 2～10:沙門菌分離菌株Sal-1～Sal-9M：DL-2 000 DNA Marker； 1：Salmonella standard strain ATCC14028； 2-10：Salmonella isolates Sal-1-Sal-9

2.2 噬菌體分離增殖與計數 試驗中成功分離到宿主為沙門菌的噬菌體毒株，經過噬菌體計數，確定其濃度為3.0×1011PFU。

2.3 沙門菌抗生素耐藥分析 使用AMP等10種常用抗生素，針對試驗中分離到的11株耐藥性沙門菌進行藥敏試驗，結果顯示，其中4株對1種抗生素耐藥，2株對2種抗生素耐藥，2株對3種抗生素耐藥，2株對4種抗生素耐藥，1株對6種抗生素耐藥(表2)。

由表2結果可知，本試驗分離的11株沙門菌多重耐藥率為63.64%(7/11)。用于檢測的抗生素中，沙門菌株對氨芐西林耐藥比例最高(81.82%，9/11)，其次為阿莫西林(63.64%，7/11)、鏈霉素(45.46%，5/11)。頭孢噻肟、恩諾沙星、氟苯尼考、林可-壯觀霉素和磺胺異噁唑對本試驗分離的沙門菌有較好的抑菌效果，其中林可-壯觀霉素和磺胺異噁唑對所有菌株均有抑制作用，恩諾沙星和氟苯尼考對分離菌株均呈現高度敏感(但恩諾沙星對Sal-4、Sal-7，氟苯尼考對Sal-4無抑制作用)。試驗分離的11株沙門菌中，編號為Sal-4的菌株，對包括氨芐西林、阿莫西林、恩諾沙星、氟苯尼考、頭孢噻肟和鏈霉素在內的6種抗生素明顯耐藥。

表2 沙門菌藥敏試驗結果(抑菌環直徑φ=mm)Table 2 Results of drug sensitivity test of Salmonella(Diameter of bacteria inhibiting zone,φ=mm)

2.4 噬菌體MOI與細菌生長曲線 根據細菌耐藥結果(表2)，Sal-4菌株表現多重耐藥，因而選擇Sal-4作為后續試驗菌株，進行噬菌體試驗。如圖2所示，當噬菌體存在時，Sal-4數量增長緩慢，在MOI分別為1∶1、1∶10和1∶100時細菌增殖趨勢無明顯差異；但在MOI為10∶1時，細菌增殖明顯滯后，此條件下的細菌生長情況不符合做后續藥敏試驗和動物試驗的要求。對比MOI為1∶1、1∶10、1∶100時細菌的生長情況，細菌在MOI為1∶10時，最符合細菌增殖滯后且滿足藥敏試驗和動物試驗條件，因此，后續試驗中選擇MOI為1∶10進行。

圖2 不同MOI下Sal-4生長曲線Fig.2 Growth curve of Sal-4 under different MOI

2.5 噬菌體對沙門菌耐藥性的影響 將試驗分離的噬菌體與多重耐藥沙門菌Sal-4共同培養后，進行藥敏試驗，結果如表3所示，與未經噬菌體處理的Sal-4菌株相比，處理后細菌對抗生素敏感性增加，表現為抗生素抑菌環直徑增加。

表3 噬菌體作用后Sal-4藥敏試驗結果(抑菌環直徑φ=mm)Table 3 Results of drug sensitivity test of Salmonella Sal-4 treated by phage(Diameter of bacteria inhibiting zone,φ=mm)

2.6 動物試驗 結果如表4所示，廣譜耐藥沙門菌Sal-4對試驗小鼠的致死率為90%(組1)，使用AMP單獨治療時，小鼠死亡率為70%(組2)，與組1無明顯差異(P>0.05)；單獨使用噬菌體治療Sal-4感染的小鼠(組 3)，小鼠死亡率明顯下降，與組2比較差異極顯著(P<0.01)，表明噬菌體可以抑制Sal-4對試驗小鼠的損傷；在應用噬菌體和AMP后(組4)，小鼠死亡率下降至20%，說明所分離的噬菌體Phage-1可以增強抗生素對Sal-4的抑制作用。

表4 Phage與AMP對Sal-4攻毒小鼠的影響Table 4 The effect of Phage and AMP on mice infected by Sal-4 (n=10)

3 討論

沙門菌特別是腸炎沙門菌，是最重要的食源性病原菌，常與禽類產品的污染有關。沙門菌每年在全球范圍內造成約9 300萬胃腸炎病例和155 000人死亡[8]。抗菌治療是治療沙門菌感染的首選方法；然而，由于抗生素在人體醫藥和動物生產中的濫用，抗菌藥物的耐藥性已成為世界性難題[9]。目前，源于畜牧業的耐藥微生物對環境和人類健康構成了嚴重挑戰。因此，弄清這些遺傳因子轉化為病原菌的來源和機制，不僅對減少治療中的感染，而且對防止微生物耐藥性的威脅具有重要意義[10]。抗生素多重藥耐藥(多重藥耐藥、極端耐藥和泛耐藥)是由適應性進化控制的，在抗生素脅迫條件下，多重藥耐藥的病原菌克隆可以成為優勢菌[11-12]。

有研究表明，對取自環境的水樣進行細菌分離和耐藥性分析，可以方便準確的評估和檢測某一地區的細菌耐藥及耐藥基因進化情況，是一種高效的病原菌檢測方式[13]。本試驗在對肉雞養殖場周圍水體取樣后，經過對水樣進行細菌分離培養，分離并鑒定出11株沙門菌，通過藥敏試驗評估所分離沙門菌的耐藥性；此外，從同一水樣中分離噬菌體，選取不同感染復數(MOI)的噬菌體單獨應用，以及與3種耐藥抗生素聯合應用，檢測噬菌體及其與抗生素聯合應用時對耐藥沙門菌的抑制作用。結果顯示，自養殖場周圍水體中分離的11株沙門菌均對常用抗生素存在耐藥現象，并且多重耐藥率高達63.64%(7/11)。由于噬菌體的普遍存在性、宿主特異性和無害性，可以與食物一起口服，同時噬菌體療法作為一種治療細菌感染的替代療法被廣泛研究，特別是針對抗生素耐藥細菌的治療使用，具有很大的應用潛力[10]。本試驗結果還顯示，在MOI為1∶10時，噬菌體對沙門菌的抑制效果最好；噬菌體與抗生素聯合應用時，可以明顯降低耐藥沙門菌對抗生素的耐藥性，試驗選擇的耐藥沙門菌Sal-4分離株，在噬菌體作用下，對抗生素的敏感性顯著增加。動物試驗結果顯示，同時使用噬菌體與氨芐青霉素治療沙門菌感染，小鼠死亡率極顯著下降(P<0.01)，說明所分離的噬菌體Phage-1可以顯著降低Sal-4對抗生素的耐藥作用。