Id1、β–catenin、cyclin D1 在結直腸腺瘤和結直腸癌中的表達意義

陳玉北 王覓柱

1.包頭醫學院研究生學院，內蒙古包頭 014040；2.包頭醫學院第二附屬醫院消化內科，內蒙古包頭 014031

結直腸癌是較常見的惡性腫瘤，近年來發生率及病死率呈上升趨勢，分別居于第3 位和第5位。在亞太地區，我國結直腸癌的發生率處于首位，發病年齡逐漸年輕化，且有研究發現其發生率城市高于農村。該疾病嚴重威脅我國民眾的健康，有研究表明大部分的結直腸癌病例由結直腸腺瘤惡變引發，結直腸腺瘤已是公認的癌前病變。結直腸腺瘤惡變的機制極其復雜，研究其分子機制具有重大意義。分化抑制因子1（differentiation inhibition factor 1，Id1）可抑制下游基因表達，起到抑制細胞分裂的作用，β–聯蛋白（β–catenin）是Wnt 通路的重要組成部分，在多種腫瘤中均存在Wnt 通路上調的情況。細胞周期蛋白D1（cyclin D1）可調控細胞周期，其高表達可引發細胞周期失控，導致腫瘤發生、發展。本研究通過檢測結直腸癌組織、癌旁組織、結直腸腺瘤中的Id1、β–catenin、cyclin D1 表達情況，分析其臨床意義并探討其可能的調控機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2021 年5 月至2021 年10 月包頭醫學院第二附屬醫院消化內鏡中心結直腸鏡下取病理的結直腸癌癌旁組織、結直腸腺瘤組織、結直腸癌組織各30 例，用于蛋白質印跡法實驗。同時收集相應組織的存檔蠟塊，用于免疫組織化學實驗。本研究全部病例均經過病理確診，臨床資料完整。納入標準：術前未進行任何抗腫瘤治療，未進行放療和化療；癌旁組織距離腫瘤>5cm。排除標準：術前經過放療、化療等抗腫瘤治療；癌旁組織距腫瘤<5cm。

1.2 主要試劑

兔抗人Id1 多克隆抗體IgG（英國Abcam 公司，稀釋度為1∶50）；兔抗人β–catenin 單克隆抗體IgG（美國Proteintech 公司，稀釋度為1∶700）；兔抗人cyclinD1 單克隆抗體IgG（美國Proteintech 公司，稀釋度為1∶100）；酶標山羊抗兔IgG 聚合物（武漢愛博泰克生物科技有限公司）；DAB 顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）；BCA 試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）。

1.3 蛋白質印跡法

待測組織研磨后加入0.4ml 蛋白酶抑制劑和蛋白裂解液，12000 轉/min 離心10min，蛋白質印跡法測上清液蛋白濃度，加樣到SDS–PAGE 中電泳，濃縮膠和分離膠電壓分別為80V、120V，時間分別為30min、70min。恒流400mA，轉膜2h，奶粉封閉后孵育一抗過夜，孵育二抗后顯影和曝片，Bio–rad 掃描條帶，ImageJ 測灰度值，所測灰度值進行歸一化處理（除以內參灰度），最終獲得相對蛋白表達量。內參蛋白選取β–actin。

1.4 免疫組織化學法

蠟塊切片固定于載玻片，烤片后脫蠟，水化后修復，加入過氧化物酶阻斷劑，孵育10min，加入一抗過夜，加入二抗孵育20min，加入DAB 顯色液，顯色后馬上放入蒸餾水，復染、反藍、脫水后封片，顯微鏡下觀察。主要觀察指標為染色強度及陽性率，強度評分：陰性為0 分、弱陽性為1 分、中陽性為2分、強陽性為3 分。陽性率評分：0 分，陰性；1 分，陽性率1%～33%；2 分，陽性率34%～66%；3 分，陽性率67%～100%。免疫組織化學評分由以上兩部分評分相加得出。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 免疫組織化學結果

Id1 主要表達于細胞質，β–catenin 主要表達于細胞核和細胞質，cyclin D1 主要表達于細胞核，陽性表達呈現棕黃色染色，見圖1。腺瘤組織中的Id1、β–catenin、cyclin D1 免疫組織化學評分均顯著高于癌旁組織，差異均有統計學意義（<0.05），結直腸癌組織中的Id1、β–catenin、cyclin D1 免疫組織化學評分均顯著高于腺瘤組織，差異均有統計學意義（<0.05)，見圖2。Spearman 相關分析結果顯示，Id1 與β–catenin表達呈正相關（=0.399，<0.01），β–catenin 與cyclin D1 表達呈正相關（=0.440，<0.01）。

圖1 Id1、β-catenin、cyclinD1 免疫組織化學染色情況（×200）

圖2 3 種組織免疫組織化學評分比較

2.2 蛋白質印跡法結果

蛋白質印跡法結果表明Id1、β–catenin、cyclin D1在癌旁組織、結直腸腺瘤、結直腸癌組織中均有表達，見圖3。腺瘤組織中的Id1、β–catenin、cyclin D1表達均顯著高于癌旁組織，差異均有統計學意義（<0.05），結直腸癌組織中的Id1、β–catenin、cyclinD1 表達均顯著高于腺瘤組織，差異均有統計學意義（<0.05），見圖4。Pearson 相關分析發現Id1與β–catenin 表達呈正相關（=0.306，<0.05）；β–catenin與cyclin D1 表達呈正相關（=0.367，<0.01）。

圖3 Id1、β-catenin、cyclin D1 的蛋白質印跡法結果

圖4 3 種組織中的Id1、β-catenin、cyclin D1 相對表達量比較

3 討論

近年來，隨著生活水平的提高，人們的飲食結構發生改變，高脂肪、高蛋白質類食物攝入過多，結直腸癌患病人數明顯上升，2020 年結直腸癌新發病例數位居所有腫瘤的第3 位，死亡病例數位居第2位。研究表明，結直腸癌大多都經歷由腺瘤發展到癌的典型病理過程，該過程一般需5～10 年，為早診斷、早治療提供了時間窗。臨床上，腺瘤惡變所引發的結直腸癌在全部病例中占比很高。因此，深入研究結直腸癌的發生發展機制十分重要。

Id1 屬于分化抑制因子（differentiation inhibition factor，Id）家族，在多種腫瘤中均表達升高，但仍無研究證明Id 基因突變及異常擴增存在于腫瘤中，因此有學者將Id 稱為準原癌基因。研究表明，Id1在結直腸癌組織中高表達，尤其是低分化癌，其表達上調更為明顯。設法降低Id1 表達后，發現結直腸癌細胞增生能力減弱、侵襲力下降，抑制Id1 表達，可抑制cyclin D1 表達，調控細胞周期，降低S 期細胞比例，抑制細胞分裂。增加Id1 表達，則可增加結直腸癌組織新生血管密度。因此，Id1 在結直腸癌中起到十分重要的促進作用，但關于Id1 在結直腸腺瘤惡變中的研究仍較少。本研究表明，Id1 在癌旁組織、腺瘤組織、結直腸癌組織中的表達逐漸升高，這也許說明，Id1 在從腺瘤到癌這個典型的過程中發揮重要作用，Id1 有望成為新的腫瘤標志物，用于結直腸腺瘤惡變的早期篩查，同時Id1 也有望成為治療的新靶點，通過抑制Id1 表達，抑制從腺瘤到癌的病理過程，阻斷結直腸癌的發生、發展。

Wnt/β–catenin 通路的上調在多種腫瘤中均有腫瘤促進作用。該通路的激活在結直腸癌中普遍存在，其調節結直腸癌細胞生物學行為的研究也較為廣泛，如下調結直腸癌中的該通路，可抑制c–Myc、T 細胞因子– 4 表達，從而抑制結直腸癌細胞的增生能力。該通路的下調也可降低腫瘤的侵襲和轉移能力。β–catenin 蛋白是通路中主要的信號分子，對該通路意義重大。Cyclin D1 是該通路下游分子，cyclin D1 激活可導致細胞周期失去原有節律，加快細胞周期進程，促進腫瘤細胞增殖。Cyclin D1已被證實為原癌基因，cyclinD1 在正常組織細胞中呈恒量表達，在諸多腫瘤細胞中呈高表達，與腫瘤關系密切。本研究表明，β–catenin 及cyclin D1 在癌旁組織、結直腸腺瘤、結直腸癌中的表達呈逐漸上升趨勢，提示在從結直腸腺瘤到結直腸癌的過程中，β–catenin 及cyclin D1 起到重要作用，有望成為新的腫瘤標志物，應用于結直腸腺瘤惡變的早期篩查中，同時也有望成為治療的新靶點，通過抑制其表達，從而阻斷結直腸癌的發生、發展。

β–catenin 及cyclin D1 在癌旁組織、結直腸腺瘤、結直腸癌中的表達呈依次上升趨勢，相關分析證明，二者的表達呈正相關性，這充分佐證cyclin D1 作為Wnt/β–catenin 通路的下游分子，受到通路的調節。有研究表明，結直腸癌細胞中的Id1 可通過激活PI3k/Akt 通路上調cyclin D1 表達。本研究證明Id1與β–catenin 呈正相關，這也許說明在結直腸腺瘤惡變過程中，Id1 也可能通過激活Wnt/β–catenin 通路進而調控cyclin D1 表達，從而起到促進腫瘤發生、發展的作用。由于結直腸腺瘤惡變過程中的分子生物學機制十分復雜，且本研究僅通過蛋白質印跡法及免疫組織化學法進行，若能進一步通過細胞學實驗對該結果進行進一步分析及驗證，則能進一步闡釋該過程中的分子生物學機制，有望為早發現、早診斷、早治療結直腸癌提供新的理論依據及分子生物學基礎。