PI3K/Akt 信號通路相關蛋白在胃癌細胞中的表達及其意義

周小雙 賴斌

1.上饒市人民醫院普外科，江西上饒 334000；2.南昌大學第二附屬醫院胃腸外科，江西南昌 330006

在中國，胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，近年來，由于針對胃癌相關篩查工作的開展、人們體檢意識的增強及相關危險因素的控制，胃癌整體發生率和病死率有一定程度的下降，但我國人口基數龐大，胃癌疾病負擔依然十分嚴重。胃癌是來源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，是胃部最常見的惡性腫瘤之一。研究表明腫瘤的形成是細胞生長、增生調控發生紊亂的結果，針對信號通路參與調控細胞生長與增生在腫瘤發生、發展過程中的作用是當下研究的熱點之一。安俊平等研究發現，磷脂酰肌醇3 激酶（phosphoinositide 3–kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/Akt）信號通路的激活可促進胃癌細胞增生、抑制凋亡、促進腫瘤細胞向DNA合成期及有絲分裂期轉化，在胃癌的發生、發展過程中起著至關重要的作用。目前以PI3K/Akt 信號通路關鍵分子為靶點的腫瘤靶向治療正在蓬勃發展。本實驗通過免疫熒光法探討PI3K/Akt 信號通路相關蛋白磷酸化PI3K（phosphorylated phosphoinositide 3–kinase，p–PI3K）、磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B，p–Akt）在胃癌細胞及正常細胞中表達的差異，分析PI3K/Akt 信號通路在胃癌發生與發展中的作用，旨在為胃癌的早期診斷、預防和治療提供新的方向。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2017 年1 月至2018 年12 月南昌大學第二附屬醫院經胃鏡病理確診為胃癌并行手術切除患者的胃癌標本100 例，同時取對應癌旁組織（距離腫瘤切緣5cm）共計100 例，所有患者既往均無放、化療及腹部手術史；術后病理明確診斷為胃癌。其中男61 例，女39 例；年齡35～78 歲，中位年齡63歲；根據最新版胃癌TNM 分期標準：Ⅰ期9 例，Ⅱ期33 例，Ⅲ期51 例，Ⅳ期7 例；分化程度：低分化41 例，中分化46 例，高分化13 例；浸潤深度：病灶穿透漿膜63 例，未穿透37 例；淋巴結轉移：發生淋巴結轉移72 例，無淋巴結轉移28 例。同時取48 例胃鏡檢查正常者的胃黏膜組織，其中男26例，女22 例，年齡31～68 歲，中位年齡58 歲。胃癌患者與檢查正常者的年齡和性別比較差異均無統計學意義（>0.05）。本研究經南昌大學第二附屬醫院倫理委員會批準（倫理審批號：研臨審2018 第105號），全部患者均簽署知情同意書。

1.2 主要方法與試劑

所有標本離體后進行甲醛固定并石蠟包埋，4μm連續切片，用免疫組織化學SP 法檢測p–PI3K、p–Akt在胃癌組織、癌旁組織及正常胃黏膜組織中的表達情況。兔抗人p–PI3K 購自北京博奧森生物技術有限公司；兔抗人p–Akt、DAB 顯色劑及免疫組織化學SP 試劑盒購自中國武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.3 結果判讀

試驗采取雙盲法，由兩位試驗參與者對染色結果進行判讀，以視野中組織細胞的細胞質及細胞核出現棕黃色顆粒為陽性表達，p–PI3K 表達于細胞質，p–Akt 主要表達于細胞質，部分表達于細胞核，根據染色程度分為無染色、淺黃色、棕黃色、黃褐色，分別代表0～3 分，得分計為a。根據視野內陽性細胞所占比例分為≤10%、>10%～25%、>25%～50%、>50%，分別代表0～3 分，得分計為b。最終評分=a×b，取兩位試驗人員評分的平均值為最終評分，最終評分≥3 分為陽性，<3 分為陰性。

1.4 統計學方法

采用SPSS 16.0 統計學軟件對數據進行處理分析。收集PI3K/Akt 信號通路中相關蛋白p–PI3K 和p–Akt 在胃癌組織、癌旁組織和正常胃黏膜中表達的相關數據，采用檢驗進行統計分析，以<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 p-PI3K、p-Akt 在胃癌組織、癌旁組織及正常胃黏膜中的表達差異

試驗結果顯示，p–PI3K、p–Akt 陽性表達的細胞質中出現明顯黃色、棕黃色顆粒，p–PI3K 在胃癌組織、癌旁組織及正常胃黏膜中的陽性表達率分別為55.0%、23.0%及14.6%；p–Akt 在胃癌組織、癌旁組織及正常胃黏膜中的陽性率分別為29.0%、13.0%及8.3%，胃癌組織中p–PI3K、p–Akt 的表達率顯著高于癌旁組織及正常胃黏膜（<0.05），見圖1、表1。

表1 胃癌組織、癌旁組織、正常胃黏膜中p-PI3K、p-Akt 的表達差異（例）

圖1 胃癌組織、癌旁組織及正常胃黏膜細胞的p-PI3K、p-Akt 的表達差異（SP 法染色）

2.2 p-PI3K、p-Akt 的表達與胃癌相關病理參數之間的關系

試驗結果顯示，胃癌組織中p–PI3K、p–Akt 的表達與患者的年齡、性別無明顯相關性（>0.05），腫瘤病理分期Ⅲ～Ⅳ期、低分化、浸潤深度穿透漿膜及淋巴結轉移的患者胃癌組織中p–PI3K、p–Akt的陽性率更高（<0.05），見表2。

表2 p-PI3K、p-Akt 的表達與胃癌相關病理參數之間的關系（例）

3 討論

腫瘤的形成是基于細胞增生、分化失控的復雜過程，本研究中的PI3K/Akt 信號通路作為細胞中重要的信號通路之一，可通過激活眾多下游效應分子，從而抑制細胞凋亡、促進細胞增生、加速腫瘤細胞侵襲及轉移，與腫瘤的發生、發展及預后密切相關。本研究發現，p–PI3K 在3 種組織細胞中的陽性率分別為55.0%、23.0%、14.6%；p–Akt 在3 種組織細胞中的陽性率分別為29.0%、13.0%、8.3%，兩種蛋白在胃癌組織、癌旁組織及正常胃黏膜組織中的表達陽性率均呈逐漸下降趨勢，差異均有統計學意義；同時通過比較不同臨床病理參數下胃癌組織細胞內的p–PI3K、p–Akt 表達陽性率后發現，不同年齡、性別的患者，其胃癌組織中的p–PI3K、p–Akt 表達差異無統計學意義；但在腫瘤不同分化程度、浸潤深度、病理分期、淋巴結轉移的基礎下，兩種蛋白質的表達率差異均有統計學意義，且從各項指標綜合分析可以看出，分化程度越低、浸潤深度越深、病理分期越晚、存在淋巴結轉移的患者兩種蛋白的表達陽性率更高。

綜合分析可以得出，PI3K/Akt 信號通路在胃黏膜細胞癌變過程中出現過度激活，激活后的信號通路在胃癌細胞的增殖、侵襲和轉移過程中起著積極作用。通過參與調控細胞周期促進腫瘤的發生，PI3K/Akt 信號通路活化后可激活哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）；mTOR 促進細胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin–dependent protein kinase，CDK）與細胞周期蛋白結合，CDK 的活化可使細胞周期啟動，促進細胞周期由G期轉換到S 期，縮短細胞周期，從而促進腫瘤的發生、發展。PI3K/Akt 通路活化后促進凋亡蛋白與伴侶蛋白結合，從而抑制凋亡復合體的形成，進而抑制腫瘤細胞凋亡；同時PI3K/Akt 通路活化后通過抑制含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase）家族中的caspase–9 的磷酸化而使之失活，進一步抑制線粒體釋放抑制細胞色素C 等凋亡因子，抑制凋亡。PI3K/Akt 通路的激活可通過激活血管內皮上的內皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS），從而在血管內生成一氧化氮，協助調節血管功能，引起血管擴張、血管重塑及血管的新生；同時上調血管表皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和其他血管生成因子，從而促進腫瘤血管的生長。PI3K/Akt 通路激活后可激活基質金屬蛋白酶（matrix metalloprpteinase，MMP），MMP 是一種鋅離子依賴的蛋白水解酶超家族。在人體中，活化的MMP 幾乎可水解所有的細胞外基質，腫瘤細胞周圍的細胞外基質水解后，使腫瘤細胞更易脫離瘤體，從而轉移到人體其他部位，進而使腫瘤的侵襲與轉移加速。淋巴結轉移是胃癌轉移的重要途徑，相關研究證實PI3K/Akt 信號通路活化后不僅可促進腫瘤生長，同樣可促進腫瘤微淋巴管的形成。Liu等研究發現PI3K/Akt 通路的活化確實可促進胃癌細胞的淋巴結轉移，究其原因可能是活化的PI3K/Akt 通路使胃癌組織內的微淋巴管密度增加，從而增加腫瘤細胞與淋巴系統的接觸面積，加速腫瘤細胞經淋巴系統擴散。

隨著研究的深入，研究者發現PI3K/Akt 信號通路的激活除了在腫瘤發生及發展過程中起著重要作用外，在腫瘤的耐藥性進程中也扮演著重要角色。研究證實在胃癌、乳腺癌及白血病等腫瘤中，PI3K/Akt 信號通路在化療耐藥的形成與維持中起著重要作用。另外，研究發現使用PI3K 抑制劑處理后的胃癌耐藥細胞對順鉑的敏感度增加，在黑色素瘤的研究中也發現PI3K 抑制劑可逆轉胰島素所引起的化療耐藥；而阻斷PI3K/Akt 信號通路可逆轉其耐藥，恢復腫瘤細胞對化療藥物的敏感度。

綜上所述，PI3K/Akt 信號通路中相關蛋白p–PI3K 和p–Akt 在胃癌組織中的表達明顯高于正常組織，同時隨著患者胃癌病情的進展，兩種蛋白的表達陽性率也逐漸升高，因此，針對PI3K/Akt 通路的相關檢測及靶向藥物的應用可作為臨床診斷及治療胃癌的一個新策略。