氣相色譜-負化學源質譜法測定辣椒中咪鮮胺及2,4,6-三氯苯酚

李 萍，徐蓓蓓，鄭欽月，王路路，劉文芳

（1.柘城縣綜合檢驗檢測中心，河南 商丘 476200；2.中檢集團中原農食產品檢測（河南）有限公司，河南 鄭州 450000）

咪鮮胺作為一種廣譜咪唑類殺菌劑，對辣椒枯萎病具有很好的防治效果[1]，因此被廣泛應用于辣椒的種植及采摘保鮮中。咪鮮胺進入環境后，會生成代謝產物2,4,6-三氯苯酚，其具有顯著的毒理學效應和潛在致癌性，可對人類神經系統和呼吸系統造成不良影響，如引起慢性支氣管炎、咳嗽和肺功能改變等[2]。2,4,6-三氯苯酚已經被美國環境保護署（EPA）列為優先污染物，在我國也被確定為水體中的優先污染物[3]。GB 2763—2021《食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》[4]中規定辣椒中咪鮮胺的最大殘留限量為2 mg/kg，殘留量以咪鮮胺及其代謝物2,4,6-三氯苯酚之和計。但目前的檢驗方法標準僅有NY/T 1456—2007《水果中咪鮮胺殘留量的測定 氣相色譜法》[5]，且該標準的適用范圍不包括辣椒及其他蔬菜。

咪鮮胺及2,4,6-三氯苯酚的檢測分析方法有光譜法[6]、電化學法[7]、氣相色譜法[8-9]、液相色譜法[10-12]、氣相色譜-質譜聯用法[13-16]和液相色譜-質譜聯用法[17-19]。光譜法、電化學法、氣相色譜法、液相色譜法樣品的前處理不僅復雜繁瑣，且還會用到毒性較大的吡啶鹽酸鹽，不利于檢驗人員的健康和環境的安全，液相色譜-質譜聯用法對設備要求比較高。氣相色譜-質譜法檢測咪鮮胺及2,4,6-三氯苯酚時常采用電子轟擊離子源（Electron ionization，EI）。由于EI源不具有選擇性，分析物容易受到多雜質干擾，易造成假陽性。研究表明，化學離子源（Chemical ionization，CI）對特定基團的化合物也具有較好的電離效果。比如負化學離子源（Negative chemical ionization，NCI）具有較弱的電離性，產生的碎片離子少，對含鹵原子具有較好的選擇性和較高的靈敏度[20]。同時，正化學離子源（Positive chemical ionization，PCI）對于含氮雜環化合物有響應，而對很多雜質沒有響應，從而可以消除多數無法離子化雜質的干擾，不易出現假陽性[21]。由于咪鮮胺和2,4,6-三氯苯酚分子結構中含氮雜環以及電負性氯原子（圖1），因此具有NCI電離的可能性。本文通過采用不同的離子源和化學電離源研究同時測定辣椒中咪鮮胺和2,4,6-三氯苯酚的方法，以期獲得良好的靈敏度和選擇性，降低假陽性。

圖1 咪鮮胺（A）及2,4,6-三氯苯酚（B）的化學結構式Fig.1 The chemical structure of prochloraz(A)and 2,4,6-trichlorophenol(B)

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

辣椒，市售；咪鮮胺（標準品濃度100μg/mL）、2,4,6-三氯苯酚（標準品濃度100μg/mL），農業農村部環境保護科研監測所；丙酮（色譜純），德國Merck公司。

乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠（Primary secondary amine,PSA）、十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18）、石墨化碳黑（Graphitized carbon black,GCB）、陶瓷均質子、有機微孔濾膜（孔徑0.45μm），美國Agilent公司。

1.1.2 儀器與設備

7890B-7200氣相色譜串聯飛行時間質譜儀，美國Agilent公司；AB204 N電子天平（精確至0.1 mg），梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 氣相色譜參數

色譜柱：VF-1701 ms（30 m×250μm×0.25μm）；進樣量：1μL；進樣方式：不分流；進樣口溫度：260℃；恒流模式，流速1.2 mL/min；傳輸線溫度：280℃；程序升溫：初溫60℃，30℃/min升至280℃，280℃保持8 min。

1.2.2 質譜參數

負化學離子源，離子源溫度150℃，發射電流20.0μA，電子能量250.0 eV，質譜采集模式Scan，采集范圍35～500 u，采集頻率2 Spec/s。

1.2.3 標準溶液的配制

以丙酮為溶劑，分別移取咪鮮胺和2,4,6-三氯苯酚標準品溶液，配成兩種10.0μg/mL的標準儲備液，再稀釋至質量濃度0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、1μg/mL的系列標準溶液。

1.2.4 凈化方式的篩選

稱取10 g辣椒，加入10 mL乙腈，均質后加入2 g氯化鈉，渦旋振蕩，4 000 r/min離心3 min，取3 mL上清液待凈化。在3 mL待凈化液中分別加入100 mg PSA、100 mg C18、100 mg GCB，凈化管中均加入300 mg無水硫酸鈉，渦旋振蕩，4 000 r/min離心3 min，過0.45μm有機濾膜，取1 mL分別加入0.2μg咪鮮胺及2,4,6-三氯苯酚，按“1.2.1”及“1.2.2”所述儀器條件測定。測定結果分別計為B-PSA、B-C18、B-GCB。

稱取10 g辣椒，分別加入2μg咪鮮胺及2,4,6-三氯苯酚，加入10 mL乙腈，均質后加入2 g氯化鈉，渦旋振蕩，4 000 r/min離心3 min，取3 mL上清液待凈化。在3 mL待凈化液中分別加入100 mg PSA、100 mg C18、100 mg GCB，凈化管中均加入300 mg無水硫酸鈉，渦旋振蕩，4 000 r/min離心3 min，過0.45μm有機濾膜，待測。測定結果分別計為C-PSA、C-C18、C-GCB。

以丙酮為溶劑分別配制0.2μg/mL咪鮮胺及2,4,6-三氯苯酚，待測。測定結果計為A。

以上測定結果均以定量離子峰面積表示。

凈化方式通過基質效應和回收率評價。基質效應的計算參照Matuszewski等[22]的方法。

式中：ME為前處理過程總基質效應，%；B為目標化合物在陰性樣品處理液基質中檢測的峰面積；A為目標化合物在純溶劑基質中檢測的峰面積；RE為前處理過程回收率，%；C為目標化合物經過前處理后處理液基質中檢測的峰面積；PE為折算回收率后的基質效應，%。

1.2.5 定性定量計算

采用“1.2.2”質譜參數中NCI采集。咪鮮胺定量離子m/z為163.063 3，定性離子m/z為161.065 5；2,4,6-三氯苯酚定量離子m/z為196.045 2，定性離子m/z為160.057 4，基質外標法定量。

1.2.6 線性范圍和定量限的測定

在空白辣椒基質中分別添加0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、1μg/mL咪鮮胺、2,4,6-三氯苯酚，按“1.2.1”及“1.2.2”所述儀器條件測定。以物質濃度為橫坐標，定量離子豐度為縱坐標進行線性回歸，確定線性范圍。

稱取10 g沒有檢出咪鮮胺及2,4,6-三氯苯酚的辣椒，分別加入咪鮮胺及2,4,6-三氯苯酚混標，添加水平均為0.1、0.2、0.5μg/mL，加入10 mL乙腈，均質后加入2 g氯化鈉，渦旋振蕩，4 000 r/min離心3 min，取3 mL上清液待凈化。在3 mL待凈化液中加入100 mg C18和300 mg無水硫酸鈉，渦旋振蕩，4 000 r/min離心3 min，過0.45μm有機濾膜，上機測試，結果以10倍信噪比確定定量限。

1.2.7 精密度和準確性的測定

稱取10 g未檢出咪鮮胺及2,4,6-三氯苯酚的辣椒，分別添加不同含量水平（0.05、0.20、1.00 mg/kg）咪鮮胺及2,4,6-三氯苯酚混標，進行精密度、準確性驗證，精密度以相對標準偏差（RSD）表示，準確度以加標回收率表示，每個濃度重復測定3次（n=3）。

1.2.8 數據處理

采用Excel處理數據并作圖。

2 結果與分析

2.1 咪鮮胺和2,4,6-三氯苯酚質譜采集模式的研究

以丙酮為溶劑分別配成5μg/mL咪鮮胺和2,4,6-三氯苯酚標準品溶液，采用“1.2.1”中的氣相色譜參數采集，獲得咪鮮胺和2,4,6-三氯苯酚的色譜圖（圖2）。由圖2可以看出，咪鮮胺的保留時間為13.396 min，2,4,6-三氯苯酚的保留時間為5.177 min，分離效果較好。咪鮮胺在NCI模式下的特征離子m/z主要為163.063 3（定量離子）、161.065 5（定性離子）；2,4,6-三氯苯酚在NCI模式下的特征離子m/z主要為196.045 2（定量離子）、160.057 4（定性離子）。

圖2 NCI模式下咪鮮胺和2,4,6-三氯苯酚標準樣品色譜圖Fig.2 Chromatogram of standard samples of prochloraz and 2,4,6-trichlorophphenol in NCI mode

2.2 凈化吸附劑對咪鮮胺和2,4,6-三氯苯酚提取效果的影響

基質效應抑制率高，回收率接近100%，則認為凈化效果好。RE值接近100%，說明吸附劑對目標物產生的吸附效果弱；RE值較低，說明吸附劑對目標物產生的吸附效果強，目標物回收率低。不同處理方式下咪鮮胺和2,4,6-三氯苯酚峰面積測定結果見表1，基質效應計算結果見表2。由表2可知，咪鮮胺經過PSA、C18處理，RE值接近100%，幾乎沒有被吸附；經GCB處理，RE值僅17.7%，說明GCB對咪鮮胺產生較強吸附。2,4,6-三氯苯酚經過C18處理，RE值接近100%，經PSA、GCB處理，RE值分別為33.2%、58.2%，說明GCB對2,4,6-三氯苯酚也產生較強吸附，與咪鮮胺相比，2,4,6-三氯苯酚極性大，而PSA能夠消除極性雜質。

表1 不同處理方式下咪鮮胺和2,4,6-三氯苯酚峰面積測定結果Table 1 Results of determination of prochloraz and 2,4,6-trichlorophenol under different treatments

表2 不同處理方式下咪鮮胺和2,4,6-三氯苯酚基質效應Table 2 Matrix effects of prochloraz and 2,4,6-trichlorophenol under different treatments 單位：%

綜上所述，在同時檢測咪鮮胺和2,4,6-三氯苯酚時，可使用C18處理親脂性雜質，使用PSA、GCB可能造成回收率降低。C18處理后咪鮮胺ME值為119.4%，2,4,6-三氯苯酚ME值為157.5%，說明都產生了基質放大效應。因此本研究使用C18作為凈化吸附劑，為降低基質效應干擾，定量使用基質標曲外標法定量。

2.3 定量限和線性范圍

由圖3中的標準曲線可以看出，咪鮮胺、2,4,6-三氯苯酚在0.01～1μg/mL的質量濃度范圍內的線性回歸方程分別為：y=2 284x-4.217 8，y=402 327x-1 617.9，R2分別為0.999 5、0.999 1，說明擬合度較好。

圖3 咪鮮胺(A)和2,4,6-三氯苯酚(B)的標準曲線Fig.3 The standard curve of prochloraz(A)and 2,4,6-trichlorophphenol(B)

結果表明，加標濃度0.05 mg/kg時，咪鮮胺和2,4,6-三氯苯酚混標定量離子信噪比均大于10，因此，咪鮮胺及2,4,6-三氯苯定量限均為0.05 mg/kg。

2.5 精密度和準確性

由表3可見，在添加水平0.05～1.00 mg/kg范圍內，咪鮮胺在辣椒中的回收率為85.0%～92.3%，RSD為0.3%～2.3%；2,4,6-三氯苯酚的回收率為82.3%～96.4%，RSD為0.8%～1.7%。表明該方法準確性、精密度良好。

表3 咪鮮胺和2,4,6-三氯苯酚加標回收率及精密度Table 3 Spike recovery and precision of prochloraz and 2,4,6-trichlorophenol

3 結論與討論

采用氣相色譜-負化學源質譜法研究了咪鮮胺及其代謝物2,4,6-三氯苯酚殘留量的檢測方法，結果表明：NCI模式下，對咪鮮胺和2,4,6-三氯苯酚的定量限均為0.05 mg/kg；研究對比了凈化吸附劑PSA、C18和GCB的凈化效果，由于PSA和GCB對咪鮮胺及其代謝物2,4,6-三氯苯酚產生較強吸附，因此最終選擇C18為前處理凈化吸附劑；在添加水平0.05～1.00 mg/kg范圍內，咪鮮胺在辣椒中的回收率為85.0%～92.3%，RSD為0.3%～2.3%；2,4,6-三氯苯酚在辣椒中的回收率為82.3%～96.4%，RSD為0.8%～1.7%。該方法準確性、精密度良好，且簡單、快速、高效，可用于同時對咪鮮胺及其代謝物2,4,6-三氯苯酚殘留量的定性和定量分析。