一種基于ESIPT原理的反應型半胱氨酸熒光探針的合成及細胞成像研究*

曹小燕，張 強，任傳清

(陜西理工大學,陜西省催化基礎與應用重點實驗室，陜西 漢中 723000)

生物硫醇如半胱氨酸(Cys, 30～200 μmol/L)、高半胱氨酸(Hcy, 5～12 μmol/L)和谷胱甘肽(GSH, 1～10 mmol/L)，是廣泛存在于細胞內的重要巰基小分子氨基酸，在維持生物體內的氧化還原穩態和蛋白質的生物學構象等方面發揮著重要的作用[1-2]。生物硫醇在細胞內的含量變化與生物體內的多種疾病息息相關，如Cys濃度異常易引起嗜睡、皮膚病、肝臟損傷、兒童生長緩慢和身體肥胖衰竭等疾病；血清Hcy濃度異常高易造成認知功能異常和心血管疾病等；GSH濃度與多種細胞功能相關如生長、代謝、對癌癥的放化療的耐藥性等[3-5]。因此實現生物硫醇的特異性檢測對于生物體內疾病的評估和診斷具有非常重要的意義。

與傳統的生物硫醇的檢測方法相比，熒光分析法因具有操作簡單、損害性小、靈敏度和準確度高等優點因此收到了廣泛關注[6-7]。近年來，國內外研究相繼報道了一些選擇性檢測Cys的熒光探針。如基于激發態分子內質子轉移(ESIPT)原理的分子，基于“酮式-烯醇式”互變異構現象，實現分子內的共軛結構發生極大的變化，光譜發生明顯的紅移，Stokes 位移值增大，有效消除熒光的自吸收現象，增強背景熒光和目標熒光的對比度，從而提高分子的靈敏度[8]。本研究設計合成了一種基于ESIPT原理的反應型Cys熒光探針(圖1，探針1)。探針1以2-(2-呋喃基)-3-羥基色酮為基于ESIPT原理的生色團，丙烯酸酯為識別基團和淬滅基團。雖然探針1沒有熒光，但在Cys存在下，淬滅基團脫落，實現水溶液條件下對Cys的選擇性識別。此外，探針1還具有低毒性和良好的細胞膜通透性，能用于活細胞內外Cys的熒光成像研究。

1 實 驗

1.1 主要試劑及儀器

2-羥基苯乙酮、丙烯酰氯、N-乙級馬來酰亞胺，上海阿拉丁試劑有限公司。

1H NMR和13C NMR經Bruker DRX-600M 型核磁共振儀測得。紫外吸收光譜經Shimazu Co UV-2600型紫外-可見分光光度計測定。熒光光譜由Hitachi F-4600型熒光分光光度計測定。ESI-HRMS經Bruker micro TOF-Q II高分辨質譜儀測定。細胞熒光成像實驗經Olympus IX73倒置熒光顯微鏡測得。

1.2 探針的合成與表征

依據文獻[9]，合成了化合物1(2-(2-呋喃基)-3-羥基色酮)。將化合物1(0.226 g, 1 mmol)溶于二氯甲烷溶液(15 mL)中，冰鹽浴條件下緩慢滴加三乙胺(0.5 mL)，滴加完畢后繼續攪拌0.5 h，繼續滴加丙烯酰氯(0.27 g, 3 mmol)的二氯甲烷溶液。TLC檢測反應完全后，少量的水淬滅反應，二氯甲烷萃取，無水硫酸鎂干燥，減壓濃縮，柱層析(PE:CH2Cl2=3:1)分離得到白色針狀晶體(0.16 g，56%)。m. p. 146.5～147.5 ℃。1H-NMR (600 MHz, CDCl3):d8.24 (d,J=7.9 Hz, 1H), 7.70 (t,J=7.7 Hz, 1H), 7.66 (s, 1H), 7.56 (d,J=8.4 Hz, 1H), 7.41 (t,J=7.4 Hz, 1H), 7.15 (s, 1H), 6.71 (d,J=17.3 Hz, 1H), 6.60 (s, 1H), 6.46 (dd,J=17.3, 10.6 Hz, 1H), 6.12 (d,J=10.5 Hz, 1H) ppm；13C-NMR (150 MHz, CDCl3):d171.87, 163.15, 155.33, 148.05, 146.31, 144.16,134.18, 134.06, 127.17, 126.34, 125.47, 123.95, 118.23, 116.44, 112.78 ppm；HEMS(ESI):m/z calculated for C16H10O5: 282.0528. Found:[M+Na+]: 305.0428。

圖1 2-(2-呋喃基)色酮-3-丙烯酸酯(探針1)的合成路線

1.3 樣品的配置與測試

準確稱取一定量的探針1溶解于DMSO中，配置為3 mmol/L的母液；各種氨基酸溶于超純水中配置為1 mmol/L的母液，使用時用乙腈-磷酸鹽緩沖溶液(CH3CN:PBS,3:7,V:V, pH 7.4)稀釋至所需濃度。于室溫條件下測定了探針1與不同濃度氨基酸的紫外吸收光譜和熒光發射光譜，Ex=360 nm，激發和發射的狹縫均為5 nm。

1.4 熒光成像

將A549細胞(1×104)接種于6孔板中，于37 ℃(5%CO2)培養箱中培養24 h后[10]，換取新的培養基，分別進行如下實驗：(1)空白組；(2)實驗組：加探針1(20 μmol/L)共孵育30 min；(3)抑制劑組：先加N-乙級馬來酰亞胺(NEM，1.0 mmol/L)[11]共孵育30 min后，然后加入探針1(20 μmol/L)繼續孵育30 min；(4)對照組：先加入巰基抑制劑N-乙級馬來酰亞胺(NEM，1.0 mmol/L)共孵育30 min后，再加入Cys(200 μmol/L)繼續孵育30 min，最后加入探針1(20 μmol/L)孵育30 min。實驗后細胞應用PBS洗滌2～3次，熒光倒置顯微鏡觀察并拍攝細胞成像。

2 結果與討論

2.1 識別性能研究

為了證明探針1具有選擇性識別Cys的能力，首先測試了探針1與Cys反應前后的紫外光譜和熒光光譜。由圖2A可知，探針1紫外光譜圖的特征吸收峰位于330 nm處；但加入Cys后，最大吸收峰快速紅移至360 nm，等吸光點位于346 nm。以上數據表明，隨著Cys的加入溶液中有新的物質產生，也證明Cys具有快速識別淬滅基團的能力。于360 nm光激發下，探針1在520 nm處的熒光較弱；但加入Cys后，520 nm處的熒光信號峰迅速增強且于化合物1的熒光光譜信號峰幾乎重疊，且在365 nm紫外燈照射下，呈現明顯的亮綠色熒光。此外，具有相似結構的巰基氨基酸(Hcy或GSH)不能引起520 nm處的熒光信號峰的快速增強，以上數據證明探針1還具有選擇性識別Cys的能力。

圖2 探針1與Cys反應前后的紫外光譜(A)和熒光光譜(B)

圖3 反應時間(A)和pH(B)對探針1與Cys反應前后熒光光譜的影響

基于此，為了進一步確定反應時間和反應溶液的pH值對探針1快速識別Cys能力的影響，測試了探針1與Cys(10倍)隨不同反應時間和pH值條件下的熒光光譜。隨著反應時間的變化，不同的巰基氨基酸與探針1的響應不同。由圖3可知，探針1具有良好的光穩定性且不受溶液pH值變化的影響；Hcy和GSH的加入，引起520 nm處熒光信號峰的變化較弱；只有Cys能夠引起520 nm處的熒光信號峰迅速增強且隨溶液pH值的增大而迅速增強，且于15 min、pH=7.4 時達到最大值。熒光光譜信號變化說明探針1具有良好的光穩定性，且與Cys反應前后呈現良好的“off-on”過程，故15 min作為探針1與氨基酸的室溫反應時間；為了方便后續熒光成像實驗研究，選擇反應體系的pH值為7.4。

2.2 靈敏度

為了進一步探究探針1的靈敏度，測試了探針1(20 μmol/L)與不同當量的Cys(0-200 μmol/L)在CH3CN:PBS(3:7,V:V, pH 7.4)中的反應熒光光譜。由圖4A可知，探針1于520 nm處的熒光信號強度與Cys濃度呈現良好的量效關系，在10～100 μmol/L范圍內濃度與熒光強度呈現良好的線性關系(y=4.127x+42.84,R2=0.9978)(圖4B)。依據檢測限的標準計算公式(LOD=3s/k)，求得探針1對Cys的最低檢測限為36.7 nmol/L，遠遠低于生物體內Cys的含量(30～200 μmol/L)。上述實驗結果表明探針1對Cys的熒光檢測選擇性顯著，線性關系良好，檢測線更低，可用于定量分析檢測生物體內Cys。

圖4 探針1與不同濃度Cys作用的熒光光譜圖(A)及線性關系圖(B)

2.3 抗干擾能力

為了證明探針1對Cys的特異性識別，測試了探針1與各種常見氨基酸的熒光響應情況。如圖5所示，可以發現探針1對其它氨基酸的響應作用相對較弱；而對Cys的響應于520 nm處能夠產生明顯的熒光信號增強。在選擇性實驗的基礎上，進一步考察了其它共存氨基酸對探針1選擇性識別Cys的影響。結果表明其它氨基酸幾乎不會干擾探針1對Cys的選擇性識別，520 nm處熒光信號強度與對照組近似。可以判定探針1對Cys具有良好的選擇性和抗干擾能力，可用于選擇性識別Cys。

圖5 探針1與不同氨基酸作用前后的熒光強度矩形圖

2.4 檢測機理

為了確定探針1與Cys的識別機理，測試了探針1與Cys反應前后的1H NMR。在探針1與Cys作用前，丙烯酸酯雙鍵中的3個氫1H NMR位于6.2～6.8 ppm；而加入Cys作用20 min后，這3個氫信號峰消失，同時在4.3 ppm處新出現1個氫信號峰，歸屬為己內酰胺中氫的特征信號峰，表明探針1與Cys發生了親核加成-環化脫保護反應，裂解出內酰亞胺，同時釋放出熒光母核；基于ESIPT機制，促使母核熒光信號增強。為了進一步解釋此反應機理，借助HRMS-ESI分析技術探索了探針1與Cys的反應前后化合物的分子離子峰。探針1的分子離子峰為m/z 305.0248，反應15 min后的分子離子峰分別位于m/z=229.0502和 122.0270，分別對應母核化合物1和過量的Cys。故推測其反應機理如見圖6所示：首先Cys的巰基與探針1的丙烯酰基的雙鍵發生Michael加成反應，隨后反應中的Cys氨基進攻酯基發生分子內的環化反應，同時釋放熒光母核化合物1和較穩定七元環化合物己內酰胺，這與文獻報道類似結構熒光探針識的別機理相一致[12]。

圖6 探針1檢測Cys的機理示意圖

2.5 熒光成像實驗

鑒于探針1對體外Cys具有良好的選擇性識別性能，繼續探究探針1對生物體內的Cys是否具有識別性能。首先借助MTT分析了探針1與細胞共同培養24 h后的細胞毒活性。結果證明探針1濃度高達50 μmol/L培養24 h后，80%以上的細胞存活狀態良好，證明探針1細胞毒性較低。接著進一步評價探針1對細胞內Cys識別性能。如圖7所示，當探針1(20 μmol/L)與A549細胞共孵育30 min后，細胞呈現出亮綠色熒光(圖7 B)；當選用生物巰基抑制劑NEM與A549細胞共孵育30 min后，再加入探針1，細胞熒光信號顯著淬滅(圖7C)；在上述實驗的基礎上，調整試驗順序，先加入生物巰基抑制劑與A549細胞共孵育30 min后，再加入Cys(200 μmol/L)繼續孵育30 min，最后加入探針1，細胞繼續發出亮綠色熒光(圖7D)。上述實驗結果證明探針1具有良好的細胞膜通透性且細胞毒性較低，可用于生物體內/外Cys的選擇性檢測，也為生物體Cys的選擇性檢測提供一種可行的分析方法。

圖7 細胞熒光成像

3 結 論

本研究基于ESIPT原理制備了一種反應型半胱氨酸熒光探針1，該探針與Cys作用后，展現出明顯的熒光“關-開”變化。光譜實驗結果表明，探針1對Cys具有Stokes位移大(160 nm)、選擇性和靈敏度高、檢出限低(36.7 nmol/L)等特征。更重要的是，探針1具有低毒、良好的細胞膜通透性，可用于細胞內外Cys的熒光成像研究。故本研究為深入研究機體內Cys的生理及病理功能，提供一種潛在的分析方法。