檢測烷基苯磺酸鑒別地溝油的免疫層析方法研究*

唐桂紅，陳華龍，江偉玲，吳帆敏，郭杰標

(1 韶關市食品藥品檢驗所，廣東 韶關 512026；2 韶關學院，廣東 韶關 512005)

地溝油是煎炸老油、泔水油、廢棄油等劣質食藥油的統稱，含有甲苯、丙醛、苯并芘等危害健康的化學物質[1]。為了禁止地溝油回流餐桌，開發準確高效的地溝油鑒別技術，成為監管部門和研究機構關注的熱點。

目前，地溝油檢測主要有理化檢測法、光譜檢測法和色譜檢測法。其中物理質檢測主要針對：凝固點、透明度、黏度、折射率和電導率[2]；化學檢測技術主要針對：酸值、碘值、羥值[3]；光譜學方法包括：紫外光譜法[4]、紅外光譜法[5]、拉曼光譜法[6]、核磁共振法[7]、太赫茲時域光譜法[8]、地溝油高光譜透射法[9]；色譜學方法包括：氣相色譜檢測地溝油中的外源微量成分[10-11]、特殊脂肪酸酯[12]，液相色譜檢測地溝油中的膽固醇[13]、辣椒堿和辣椒素[14-15]、黃曲霉素[16]、陰離子型表面活性劑[17]。在以上檢測中，基于理化檢測方法的專屬性不顯著，容易發生誤檢和漏檢。而依賴實驗室設備的光譜和色譜檢測操作復雜，難以現場操作。已在食品檢測領域廣泛應用免疫層析法[18]，以靈敏特異、快速價廉的特點[19]，引起了研究人員的注意：吳倩等[20]基于檢測辣椒堿的免疫層析快速鑒別地溝油，李軍濤等[21]建立了檢測黃曲霉毒素B1免疫熒光層析法鑒別地溝油，都展示了滿意的效果。相比于辣椒堿和黃曲霉毒素B1，十二烷基苯磺酸在地溝油中的殘留更為普遍[17，22-24]，研發檢測該殘留物的免疫層析試劑更有應用前景。

圖1 烷基苯磺酸類表面活性劑熒光免疫層析檢測

本研究如圖1的原理，開發快速檢測十二烷基苯磺酸的熒光免疫層析法(Fluorescent immunochromatographic assay, FICA)，為食品安全監管部門提供基于十二烷基苯磺酸殘留，快速鑒別的地溝油的可靠工具。

1 材料與儀器

1.1 材 料

1.1.1 實驗動物

新西蘭大白兔,廣州華東信華實驗動物中心(證號44007600002936);實驗動物在麗珠集團利民制藥廠動物中心飼養。

1.1.2 主要藥品及試劑

十二烷基苯磺酸鈉對照品，默克公司；牛血白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、碳二亞胺(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、四甲聯苯胺(TMB)、過氧化脲，上海生工生物工程有限公司；對氨基苯磺酸、對磺基苯甲酸、對甲基苯磺酸，阿拉丁化學試劑有限公司；羊抗兔IgG二抗酶結合物，美國Jackson公司；熒光微球(150 nm)，上海杰一生物有限公司；羊抗兔IgG二抗，美國SIGMA公司；NC膜、玻璃纖維膜、PVC襯板、吸水墊，美國Millipore公司；其余試劑均為國產分析純。

1.1.3 主要儀器

酶標板，廣州潔特；紫外/可見光掃描儀，美國Thermo公司；酶標儀，芬蘭Labsystems公司；BioJetXYZ3000型噴膜儀和切條機，上海捷寧公司。

2 方 法

2.1 人工免疫原的合成

如圖1根據改良活潑酯法，取2.0 mg對磺基苯甲酸溶于1.0 mL甲醇，加入2.5 mg NHS和3.5 mg EDC，室溫震蕩反應過夜，生成對磺基苯甲酸活潑酯，10000 rpm離心10 min除去雜質。上清液緩慢滴入含20 mg BSA的0.15 mol·L-1NaHCO3溶液(5 mL)，室溫磁力攪拌2 h，合成對磺基苯甲酸免疫抗原。反應完全后，抗原液用生理鹽水透析72 h，期間換透析液六次，分裝于-20 ℃保存。

2.2 人工檢測抗原的合成

如圖1根據重氮法，取2.0 mg對氨基苯磺酸溶于1.0 mL甲醇，用鹽酸調節pH值到1.0，在冰浴中加入2.5 mg NaNO2震蕩反應1 h，生成重氮化對氨基苯磺酸，緩慢滴入含40 mg OVA的pH 8.5 0.15 mol·L-1碳酸緩沖液(10 mL)，4 ℃磁力攪拌2 h，合成對氨基苯磺酸檢測抗原。反應完全后，抗原液用生理鹽水透析72 h，期間換透析液六次，分裝于-20 ℃保存。

2.3 動物免疫

以免疫抗原(對磺基苯甲酸-BSA偶聯物)新西蘭大白兔進行免疫。首免以完全弗氏佐劑乳化50 μg免疫抗原，背部多點皮下免疫。首免4周后，以不完全弗氏佐劑乳化50 μg免疫抗原加強免疫，之后每3周加強免疫一次，共3次。最后免疫6天后心臟取血，分離血清存放于-20 ℃。

2.4 抗體純化及特異性的評價

以辛酸-硫酸銨法純化抗體。參照前期工作的方法[25]，以十二烷基苯磺酸鈉、對甲基苯磺酸鈉、對氨基苯磺酸鈉、對磺基苯甲酸、苯磺酸、苯甲酸、苯胺，進行競爭ELISA檢測，分別繪制競爭抑制曲線，計算對各藥物IC50值，計算交叉反應率。

2.5 熒光微球的標記

按前期工作的方法[26]，采用EDC活化法對羧基化熒光微球標記抗體。取1.0 mL熒光微球稀釋在20 mL超純水中，加入0.05 mL新鮮配制的EDC溶液(10 mg·mL-1)，室溫攪拌20 min使羧基活化。將預活化微球分成三等份，分別加入抗苯磺酸抗體至終濃度0.20、0.30、0.40 mg·mL-1，輕微攪拌30 min使活化羧基與抗體的氨基連接。各種抗體濃度標記的微球以16000 rpm低溫離心30 min，分別用含10% Triton X-100的PBS溶液重懸微球，4 ℃保存備用。

2.6 免疫熒光微球層析(FICA)試紙的組裝

將抗體標記的熒光微球溶液噴在熒光微球釋放墊上，真空凍干后備用。用0.01 M PBS分別配制0.15、0.30、0.45、0.60 mg·mL-1的檢測抗原溶液，以及0.30 mg·mL-1的羊抗兔IgG二抗溶液。上述梯度濃度檢測抗原溶液和固定濃度二抗溶液形成四種組合，用噴涂設備分別在NC膜平行噴涂，構成含不同測試線(T線)和質控線(C線)四種NC膜，在37 ℃恒溫干燥后備用。

如圖2(a)所示，在60 mm×300 mm的PVC襯墊上，按順序粘貼樣品墊、熒光微球釋放墊、NC膜(T線和C線)、吸收墊，用切條機縱向切成5 mm×60 mm的試紙條。

圖2 熒光微球試劑條裝配示意圖(a)和熒光免疫試紙條檢測結果的判定(b)

2.7 FICA檢測過程和結果判讀

用滴管在樣品墊加3～4滴樣品液，樣品液吸收墊運動，并帶動在釋放墊上的標記熒光微球移動。烷基苯磺酸鈉和T線檢測抗原競爭性與金標抗體結合，產生檢測信號。熒光微球的結果判讀：如圖2(b)所示，C線和T線都顯熒光，樣品不含烷基苯磺酸鈉；C線顯色而T線不顯熒光，顯示樣品含烷基苯磺酸鈉；C線如不顯熒光，則表明試劑已經失效。

2.8 FICA試紙檢測限優化

調整抗體標記濃度和抗原噴涂濃度，優化FICA對SDBS的檢測靈敏度。用PBS配制800、400、200、100、50、25 ng·mL-1的烷基苯磺酸鈉溶液，按2.7步驟對從高濃度到低濃度進行檢測，使T線熒光消失的最后濃度就是試紙條的最低檢測限。

2.9 FICA試劑檢測油脂中SDBS殘留結果驗證

在100 mL的純凈食用油中，分別滴加含0.5、1.0、1.5、2.0 μg SDBS的5.0 mL水溶液，充分攪拌后在105 ℃烤箱加熱5 h蒸發水分。用5 mL的PBS溶液對5 mL油樣品充分震蕩抽提，在3000 rpm離心15 min破乳分層。取水相溶液按照2.7步驟檢測。每個添加濃度的油脂抽提5次進行檢測，分別統計結果對檢測性能進行評價。

3 結果與討論

3.1 抗體特異性的評價

如表1所示，抗體對十二烷基苯磺酸鈉具有很好的親和力。同時，對4-甲基苯磺酸、4-氨基苯磺酸、4-磺基苯甲酸、苯磺酸等含苯磺酸基團的化合物，對ELISA檢測(基于4-磺基苯甲酸抗體和對氨基苯磺酸抗原)的競爭抑制效應明顯。證明本研究獲得的抗體，識別苯磺酸基團的特異性良好，能夠用于苯磺酸類表面活性劑的檢測。

表1 抗體對8種相關化合物的交叉反應率

3.2 檢測線和質控線包被濃度優化

如圖3所示，當熒光微球抗體包被濃度達到0.30 mg/mL、檢測抗原包被濃度達到0.45 mg/mL，檢測線的熒光信號趨于穩定。在此基礎上可以對FICA試紙條檢出限進行優化。

圖3 抗體標記濃度(a)和檢測抗原噴涂濃度(b)

3.3 FICA試紙條檢測限優化結果

圖4 熒光免疫層析試劑(FICA)對SDBS標準溶液的最低檢測限驗證結果

為了使試劑的檢測性能更穩定，優化的FIAC試紙條選用了0.30 mg/mL抗原噴涂T線，選用0.45 mg/mL抗體標記的熒光微球作為檢測信號。FIAC試紙條檢測SDBS靈敏度驗證結果如圖4所示，檢測結果顯示不含烷基苯磺酸鈉的結果，C線和T線都顯熒光。含25 ng/mL烷基苯磺酸鈉的樣品，檢測線很大程度被抑制。烷基苯磺酸鈉濃度等于或大于50 ng/mL，檢測線全部被抑制。因此，本FICA試劑對烷基苯磺酸鈉完全競爭抑制的檢測限是50 ng/mL，完全滿足檢測油脂中烷基苯磺酸鑒別地溝油的要求。

3.4 FICA試劑檢測油脂SDBS檢出限的驗證結果

在100 mL油脂的添加不同殘留量的SDBS，使用本研究開發的FICA試劑進行檢測，實驗結果如圖5所示，SDBS添加量為0.5 μg/100 mL和1.0 μg/100 mL的油脂，全部均未檢出陽性結果；SDBS添加量為1.5 μg/100 mL油脂，5個樣品檢出弱3個陽性結果，2個陽性結果；SDBS添加量為2.0 μg/100 mL油脂，5個樣品全部檢出陽性結果。

圖5 熒光免疫層析試劑(FICA)對添加梯度SDBS標準品的油脂檢測限驗證結果

根據3.3的FICA試劑的檢測限驗證結果換算，如果PBS溶液對油脂中的SDBS抽提率為100%，對試劑油脂的檢出限應該是0.5 μg/100 mL。由于SDBS是帶有長鏈烷烴的表面活性劑，較強的油溶性使其水溶劑抽提率不會太高[24]，所以FICA試劑對油脂的檢測限2.0 μg/100 mL，換算成國家標準單位20 μg/kg是合理的。參考高效液相色譜-熒光法測定地溝油中SDBS的檢出限為1.0 mg/kg[17]，都能夠可靠鑒定地溝油。本實驗研發的通過檢測油脂中SDBS的FIAC試劑，能夠勝任鑒別地溝油的檢測任務。

4 結 論

烷基苯磺酸相對分子量只有326.49，是只有免疫反應性而沒有免疫原性的半抗原，而其免疫原性主要是“苯磺酸”基團。本研究應用改良活潑酯法合成突出“苯磺酸”基團的人工免疫原，免疫動物獲得抗“苯磺酸”抗體。競爭ELISA實驗證明抗體對含“苯磺酸基團”的化合物具有良好的親和力，而對不含“苯磺酸基團”的化合物沒有交叉反應性。以該抗體標記熒光微球，結合4-氨基苯磺酸合成的突出“苯磺酸”基團的抗原，制備了免疫熒光微球層析(FICA)試紙條，對SDBS標準品溶液的最低檢測限為50 ng/mL，對添加SDBS油脂的最低檢測限為20 μg/kg。本實驗研發的通過檢測油脂中SDBS的FIAC試劑，能夠勝任鑒別地溝油的檢測任務。