共培養時釀酒酵母對速生梭菌己酸代謝的影響及其機理

晉湘宜，趙 婷，王家勝，李 良，李俊薇，陳茂彬，方尚玲,*

（1.湖北工業大學生物工程與食品學院，湖北 武漢 430068；2.黃鶴樓酒業有限公司，湖北 武漢 430050）

己酸菌是經培養能夠生成己酸的一類微生物的統稱。目前從濃香型白酒窖泥中篩選出的己酸菌主要是以乙醇為底物合成己酸的微生物，如克氏梭菌（）、速生梭菌（）、酪酸梭菌（），以及以乳酸為底物合成己酸的微生物，如瘤胃菌（Ruminococcaceae）。近幾年朱曉軍等也從窖泥中分離出1 株葡萄糖營養型的己酸菌，屬于瘤胃球菌科梭菌屬。

濃香型白酒的生產是多種微生物協同作用的過程，酵母是完成乙醇發酵的主體微生物，己酸菌利用酵母代謝生成的乙醇及其他微生物生成的有機酸合成己酸，己酸與乙醇酯化形成濃香型白酒的特征風味物質己酸乙酯。研究己酸菌與酵母之間的相互作用對探究濃香型白酒發酵機理有重大意義。濃香型白酒的生產是利用高粱等谷物原料邊糖化邊發酵的過程，谷物原料經蒸煮糊化后拌曲入窖池密封發酵。隨著發酵過程的進行，酒醅中的淀粉、葡萄糖、乙醇、有機酸等物質滲入窖泥，為窖泥中的微生物補充生長所需的營養成分。在不同營養條件下研究釀酒酵母（）對己酸菌己酸代謝的影響，更接近兩種微生物在窖池中的實際情況，有助于解析濃香型白酒實際生產過程中己酸菌與酵母的代謝情況。

目前關于己酸菌與酵母間互作關系的研究主要集中于己酸菌代謝產物對的影響、添加對己酸菌產酸的影響等方面。而針對不同碳源條件下對己酸菌的影響及其機理的研究較少。以實驗室前期從窖泥中篩選得到的1 株可產己酸的JSJ-1和C-1為研究對象，在葡萄糖為唯一碳源和乙醇、葡萄糖為碳源這2 種營養條件下，比較2 種微生物純培養、共培養過程中生長代謝（菌落數、葡萄糖、乙醇、丁酸、己酸）的差異，分析對己酸菌己酸代謝的影響及其機理，旨在對濃香型白酒的發酵過程有更加深入的認識，為進一步優化發酵工藝提供一定理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

分離自濃香型白酒廠優質老窖泥，命名為JSJ-1，保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC M 2020881；命名為C-1，實驗室篩選并保藏。

1.1.2 培養基

乙醇乙酸鈉（sodium ethyl acetate，ES）培養基：酵母膏1 g、無水乙酸鈉0.5 g、硫酸銨0.05 g、MgSO·7HO 0.02 g、KHPO0.04 g、蒸餾水100 mL，滅菌后加入無水乙醇2 mL、干熱滅菌后CaCO1 g。

酵母膏胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養基：酵母膏1 g、蛋白胨2 g、葡萄糖2 g、水100 mL。

復合培養基A：葡萄糖4 g、酵母膏1 g、無水乙酸鈉0.5 g、硫酸銨0.05 g、MgSO·7HO 0.02 g、KHPO0.04 g、蒸餾水100 mL。

復合培養基B：葡萄糖0.5 g、酵母膏1 g、無水乙酸鈉0.5 g、硫酸銨0.05 g、MgSO·7HO 0.02 g、KHPO0.04 g、蒸餾水100 mL。滅菌后加入無水乙醇2 mL、干熱滅菌后的CaCO1 g。

1.1.3 試劑

酵母膏、無水乙酸鈉、無水硫酸鈉、無水乙醇、葡萄糖、CaCO、氯化鈉、硫酸銨、MgSO·7HO、KHPO、二氯甲烷（均為分析純），乙酸、丁酸、己酸（均為色譜純） 國藥集團化學試劑有限公司；2.5 L圓底立式厭氧培養袋 青島高新技術產業園海博生物科技有限公司；厭氧產氣袋 日本三菱公司。

1.2 儀器與設備

LRH-250生化培養箱 上海智城分析儀器有限公司；LDZX-50KBS高壓蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械廠；WFJ 2000分光光度計 江蘇海門市麒麟醫用儀器廠；5977B-7890B氣相色譜-質譜聯用儀 美國安捷倫公司；SBA-40D生物傳感分析儀 山東省科學院生物研究所。

1.3 方法

1.3.1 種子液的制備

JSJ-1種子液的制備：JSJ-1種子液的培養使用18 mm×180 mm的試管，裝液量為30 mL。將JSJ-1斜面接種到ES培養基，用封口膜密封，34 ℃靜置培養7 d。

C-1種子液的制備：將C-1斜面接種到裝有YPD液體培養基的三角瓶中，置于30 ℃、200 r/min的搖床中培養16 h。

1.3.2 不同營養條件下C-1對JSJ-1生長及代謝的影響

1.3.2.1 葡萄糖為碳源

在ES培養基的基礎上使用不同用量葡萄糖替換乙醇，葡萄糖質量分數分別設置為1%、2%、3%、4%、5%。將接種到培養基中培養3 d，檢測乙醇含量。根據前期實驗結果，乙醇添加量為體積分數2%時最適合產己酸。故選擇C-1發酵3 d乙醇約為16 g/L的葡萄糖含量作為下一步C-1與JSJ-1共同培養時培養基中葡萄糖含量，培養基命名為復合培養基A。然后在此培養基中將C-1與JSJ-1種子液按體積比2∶1同時接入，總接種量為5%。C-1與JSJ-1相同情況下單獨培養作為對照組。培養條件均同己酸菌種子液的培養。培養9 d，定期取樣檢測。

1.3.2.2 葡萄糖和乙醇為碳源

為探究在葡萄糖和乙醇同時存在時，C-1除提供底物和消耗氧氣外對JSJ-1的生長代謝是否還存在其他影響。在ES培養基基礎上添加0.5%葡萄糖作為共培養培養基，命名為復合培養基B。

由交叉劃線觀察C-1對JSJ-1生長的影響：在復合培養基B固體平板上，將JSJ-1和C-1分別采用不同的劃線順序接種，34 ℃厭氧培養4 d后觀察兩種菌的生長情況。將接種好的平板倒置放入2.5 L厭氧培養袋，放入1 包厭氧產氣袋，迅速密封提供厭氧環境。

液體共培養探究C-1對JSJ-1生長及代謝的影響：將培養好的JSJ-1種子液與C-1種子液按體積比為1∶2同時接種到復合培養基B，接種量為5%。C-1與JSJ-1相同條件下分別單獨培養作為對照組。培養條件均同JSJ-1種子液的培養。培養12 d，定期取樣檢測。

1.3.3 菌落數的測定

定期取發酵液，用生理鹽水梯度稀釋后取100 μL涂布于復合培養基B固體平板上，倒置裝入2.5 L立式厭氧培養袋，加入1 包厭氧產氣袋，迅速密封。置于培養箱內，34 ℃培養4 d，分別記錄C-1與JSJ-1的菌落數。

1.3.4 有機酸的定量測定

有機酸測定采用液液微萃取-氣相色譜-質譜聯用法。液液微萃取：取200 μL發酵液，然后加入100 μL 2%稀硫酸將pH值調至約為2，加入2 mL二氯甲烷，使用渦旋振蕩儀充分振蕩，靜置30 min待溶液分層。將上層發酵液吸出，然后加入過量無水硫酸鈉，在-80 ℃冰箱放置4 h除去水分。然后使用0.22 μm有機濾膜過濾，每毫升發酵液中加入20 μL內標溶液，裝入進樣瓶自動進樣。內標溶液為18.18 g/L的2-乙基丁酸溶液。

氣相色譜條件：DB-Wax石英毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），初始柱溫為45 ℃，保留1.5 min，以6 ℃/min升溫至85 ℃，保持0 min，再以4 ℃/min升溫至115 ℃，保持0 min，再以3 ℃/min升溫至190 ℃，保持0 min，再以5 ℃/min升溫至225 ℃，保持3 min，進樣口溫度260 ℃，載氣為氦氣（He）（99.999%），載氣流量為10.7 mL/min，分流進樣，分流比10∶1，溶劑延遲5 min。

質譜條件：離子源為電子電離源，離子源溫度為230 ℃，四極桿溫度為150 ℃，電子能量為70 eV，發射電流為34.6 μA，倍增器電壓為1 294 V；接口溫度為280 ℃，質量范圍為/50～600，對采集到的質譜圖根據化合物峰離子對照NEST數據庫檢索定性。

1.3.5 乙醇與葡萄糖的測定

采用生物傳感分析儀檢測。

1.4 數據處理

使用GraphPad Prism 8對數據進行處理和作圖分析，使用CorelDRAW 2019對圖片進行處理和組合。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖為碳源S. cerevisiae C-1對C. celerecrescens JSJ-1生長及代謝的影響

在濃香型白酒的生產過程中，一般認為對己酸菌的影響主要為生成的乙醇為己酸菌提供合成己酸的底物，另外前期利用氧氣進行生長可以為己酸菌生長創造有利的環境。故在培養基中唯一碳源為葡萄糖時同時接種和己酸菌，驗證利用葡萄糖生成的乙醇可為己酸的合成提供底物。

圖1 不同葡萄糖添加量條件下乙醇的生成情況Fig. 1 Ethanol production at different glucose concentrations in the medium

如圖1所示，當葡萄糖添加量為4%時，C-1靜置培養3 d乙醇質量濃度為15.6 g/L，最接近JSJ-1產己酸的最佳乙醇添加量。故將復合培養基A中葡萄糖設置為4%。

圖2 葡萄糖為碳源時S. cerevisiae C-1對C. celerecrescens JSJ-1生長及代謝的影響Fig. 2 Effect of S. cerevisiae C-1 on the growth and metabolism of C. celerecrescens JSJ-1 utilizing glucose as the carbon source

如圖2所示，JSJ-1在4%葡萄糖為碳源的復合培養基A單獨培養時，利用了少量的葡萄糖用于生長，生成某些酸性物質引起pH值迅速下降，未生成己酸。C-1單獨培養時，葡萄糖在第3天已被完全利用，生成了乙醇，后期乙醇含量幾乎不變，未生成己酸。當JSJ-1與C-1共同培養時，葡萄糖含量變化趨勢與C-1單獨培養時相同，乙醇含量在第3天最高，第6天開始下降，同時對應己酸的生成。這與己酸菌合成己酸的逆β氧化途徑相符，己酸菌利用乙醇生成乙酰輔酶A，然后通過碳鏈的延伸依次生成丁酸和己酸。說明當葡萄糖為唯一碳源時，C-1可將葡萄糖轉化為乙醇，為JSJ-1提供合成己酸的底物。

2.2 葡萄糖和乙醇同時存在S. cerevisiae C-1對C. celerecrescens JSJ-1生長及代謝的影響

2.2.1 交叉劃線觀察

圖3 C. celerecrescens JSJ-1與S. cerevisiae C-1的交叉劃線結果Fig. 3 Cross-streaking results of C. celerecrescens JSJ-1 and S. cerevisiae C-1

在置于厭氧培養袋內的固體復合培養基B上34 ℃培養，JSJ-1菌落呈淺褐半透明狀，C-1菌落呈白色。根據圖3A，當JSJ-1先劃線C-1后劃線時，C-1與JSJ-1接觸后的后半段肉眼觀察到的菌落仍然是酵母菌，未觀察到JSJ-1；由圖3B可以看出，當C-1先劃線至平板，JSJ-1后劃線時，交叉點的后半段觀察到菌落為C-1而不是JSJ-1。當劃線至與C-1的交叉點后，接種環上既有JSJ-1也有C-1。JSJ-1為可耐受一定氧氣的厭氧菌，而C-1為兼性厭氧，較JSJ-1而言生長速度更快，所以會優先利用營養物質。這說明，此培養條件下，兩種微生物同時接種，C-1比JSJ-1更具有生長優勢，會占據主要地位。

2.2.2 液體共培養

如圖4A所示，JSJ-1單獨培養時丁酸質量濃度在前7 d幾乎不變，第8～10天迅速上升至約2 g/L，之后開始下降。共培養時丁酸質量濃度在前2 d迅速上升至約2 g/L，之后開始下降。共培養時丁酸的生成及下降均早于JSJ-1在復合培養基中單獨培養。

如圖4B所示，當JSJ-1單獨培養時，第8天開始生成己酸，第12天己酸產量達9.70 g/L。C-1與JSJ-1共同培養時，己酸在第4天開始生成，第12天己酸產量為9.64 g/L。C-1與JSJ-1共同培養相比JSJ-1單獨培養使己酸生成時間提前了4 d，發酵12 d己酸產量相差不大。根據己酸菌利用乙醇生成己酸的逆β氧化途徑，6分子乙醇氧化生成1分子乙酸，另外5分子生成乙酰輔酶A，乙酰輔酶A與乙酸結合生成丁酸，丁酸再與乙酰輔酶A結合生成己酸。丁酸是合成己酸的中間產物，說明己酸菌與共培養可以促進己酸的生成。

由圖4C可知，C-1在復合培養基B中單獨培養時，乙醇含量并未升高，反而略有下降，可能由于培養基中葡萄糖含量偏低，主要被用來供C-1進行生長和繁殖，沒有多余的葡萄糖代謝生成乙醇。C-1單獨培養時，乙醇下降的原因主要為培養過程中揮發損失。JSJ-1與C-1共培養時乙醇含量也一直處于下降趨勢。可見，在復合培養基B中JSJ-1與C-1共培養時丁酸及己酸生成的提前并不是由于C-1利用葡萄糖生成了乙醇為JSJ-1提供底物。

由圖4D、E可以看出，當JSJ-1與C-1液體共培養時，第1天生長的菌落主要為C-1，葡萄糖在第1天基本耗盡，C-1的菌體量第1天最高，之后持續下降。JSJ-1的菌落數在第2天開始緩慢增長，第5天時數量最高，之后緩慢下降。這與平板交叉劃線得出的結論一致，在復合培養基中，C-1比JSJ-1更占據生長優勢，會優先生長，培養基中的葡萄糖主要是被C-1消耗用于生長和繁殖。

由前期實驗得知，葡萄糖對JSJ-1產己酸有抑制作用，會使己酸的生成延遲。當JSJ-1與C-1在液體復合培養基共培養時，C-1占據生長優勢，會利用大部分的葡萄糖，緩解JSJ-1利用葡萄糖對產己酸的抑制作用，從而使丁酸、己酸的生成時間提前。

圖4 葡萄糖和乙醇為碳源時S. cerevisiae C-1對C. celerecrescens JSJ-1生長及代謝的影響Fig. 4 Effect of S. cerevisiae C-1 on the growth and metabolism of C. celerecrescens JSJ-1 utilizing glucose and ethanol as the carbon source

3 結 論

在葡萄糖為碳源和乙醇、葡萄糖為碳源這2 種營養條件下探究了C-1對JSJ-1己酸代謝的影響。在葡萄糖為唯一碳源時，C-1利用葡萄糖生成乙醇，為JSJ-1提供合成己酸的底物。在乙醇與葡萄糖同時存在時，由于C-1比JSJ-1更具有生長優勢，會優先利用葡萄糖進行生長繁殖，緩解葡萄糖對己酸菌產己酸的抑制作用。本研究確定了共培養時對己酸菌的影響及其機理，對濃香型白酒釀造過程中兩種微生物間的相互作用機制有了更清晰的認識，可為后續將與己酸菌復配應用于窖池養護提供重要參考依據。