江蘇甘薯上常見(jiàn)病毒種類(lèi)鑒定及多樣性分析

羅勤川，唐 偉，孫厚俊，馬居奎，楊冬靜，陳晶偉，王 芳，謝逸萍，張成玲*

（1.江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所/中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 甘薯研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部 甘薯生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 徐州 221131；2.寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 寧波 315040）

甘薯［Ipomoea batatas （L.） Lam.］ 是我國(guó)主要的糧食作物之一，因其營(yíng)養(yǎng)豐富而成為世界衛(wèi)生組織推薦的最佳食物，其還是能源、飼料、食品加工等主要原料之一，近年來(lái)甘薯植株也作為觀賞植物出現(xiàn)在人們的視野里。甘薯具有獨(dú)特的耐貧瘠和適應(yīng)性廣的特點(diǎn)，分布于世界 上100 多個(gè)國(guó)家和地區(qū)。我國(guó)是世界上第一大甘薯生產(chǎn)國(guó)，據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)以占全球 29.0%的甘薯種植面積貢獻(xiàn)了57.0%的產(chǎn)量。我國(guó)甘薯的種植面積和產(chǎn)量均居世界第一，單產(chǎn)是世界平均水平的 1.74 倍［1-2］。甘薯病毒病的發(fā)生嚴(yán)重影響了甘薯的產(chǎn)量和品質(zhì)，尤其是近幾年甘薯上不同病毒的復(fù)合侵染，造成了甘薯葉片黃化、明脈、皺縮，植株矮小，多分枝，不結(jié)薯或結(jié)薯小、薯塊裂皮等。甘薯一旦感染病毒，終生帶毒，并隨著病毒在甘薯薯塊和薯苗中不斷積累，進(jìn)而對(duì)甘薯的品質(zhì)和產(chǎn)量造成不可估量的損失［3-5］。

據(jù)報(bào)道，全世界已經(jīng)鑒定出的能侵染甘薯的病毒有9個(gè)科32個(gè)種［4］，主要包括馬鈴薯Y病毒屬的甘薯羽狀斑駁病毒（Sweet potato feathery mottle virus，SPFMV）、甘薯輕型斑點(diǎn)病毒（Sweet potato mild speckling virus，SPMSV）、甘薯潛隱病毒（Sweet potato latent virus，SPLV）、 甘薯 G 病毒（Sweet potato virus G，SPVG）、 甘薯 C 病毒（Sweet potato virus C，SPVC）等，毛形病毒屬的甘薯褪綠矮化病毒（Sweet potato chlorotic stunt virus，SPCSV）和甘薯病毒屬甘薯輕斑駁病毒（Sweet potato mild mottle virus，SPMMV）等［5］。在我國(guó)已經(jīng)檢測(cè)出的20余種甘薯病毒中［6-10］，由馬鈴薯Y病毒屬病毒尤其是SPFMV與SPCSV協(xié)生侵染造成的甘薯病毒病的發(fā)生較為嚴(yán)重，在全國(guó)各地均有相關(guān)的報(bào)道，一般會(huì)造成產(chǎn)量損失 20%～40%，嚴(yán)重時(shí)造成甘薯減產(chǎn)幅度達(dá)50%以上，甚至絕收［9-11］。

SPFMV是典型的馬鈴薯Y屬病毒屬，基因組為+ssRNA，編碼1個(gè)大的開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORF），通過(guò)水解酶酶切形成10個(gè)成熟蛋白。其中根據(jù)外殼蛋白（Coat Protein，CP）氨基酸及核酸序列將SPFMV分成3個(gè)株系：O、EA和RC［12］，這3種株系在中國(guó)均有發(fā)生，其中O株系為主流株系［13］。SPCSV為二分體病毒，其基因組有2條+ssRNA，能與多種病毒協(xié)生侵染甘薯引起更為嚴(yán)重的產(chǎn)量損失。根據(jù)血清學(xué)可將SPCSV分為WA和EA這2個(gè)株系，這2個(gè)株系在我國(guó)均有報(bào)道，其中WA株系更為普遍［14］。目前關(guān)于江蘇省甘薯病毒的種類(lèi)鑒定以及對(duì)SPFMV、SPCSV等種群變化暫未有相關(guān)報(bào)道。

近年來(lái)，全國(guó)各地對(duì)甘薯病毒病的發(fā)生種類(lèi)及發(fā)展趨勢(shì)報(bào)道越來(lái)越多，但是江蘇地區(qū)關(guān)于甘薯病毒種類(lèi)的報(bào)道較少，為明確江蘇甘薯種植區(qū)甘薯病毒病原物的種類(lèi)及發(fā)生趨勢(shì)，本研究對(duì)2014、2016和2018年采集到的29個(gè)甘薯樣品，利用分子生物學(xué)方法進(jìn)行鑒定和遺傳多樣性分析，以期對(duì)甘薯病毒病發(fā)生的預(yù)測(cè)及防治提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

2014～2018年，分別從江蘇徐州、連云港、鹽城等地采集表現(xiàn)植株矮化、葉片皺縮、畸形、花葉等疑似病毒病的甘薯樣品29個(gè)，每個(gè)樣品分為2份，1份作為接穗，嫁接到巴西牽牛（Ipomoea setosa）上，另1份樣品經(jīng)液氮冷凍后放置于-80 ℃超低溫冰箱中備用。

1.2 試驗(yàn)方法

嫁接檢測(cè)：將巴西牽牛種子清洗干凈，放到121 ℃滅菌的培養(yǎng)皿中，加入滅菌水漫過(guò)種子浸泡12 h后，倒掉水后保濕直到種子冒出白色根后播種到小花盆中，每盆2棵。出苗后生長(zhǎng)到4～6葉期時(shí)，距離最下面1葉下方約5 cm處，用消毒過(guò)的刀片斜向下切出接口，取發(fā)病甘薯枝條作為接穗，嫁接到巴西牽牛上，封口膜封住傷口，放置在自然條件下，采用防蟲(chóng)網(wǎng)罩住，培養(yǎng)10～20 d觀察并記錄巴西牽牛新生葉有無(wú)皺縮、褪綠、花葉等癥狀。

分子檢測(cè)：取1 g左右葉片樣品，采用多糖多酚植物總RNA快速提取試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司提供］提取植物總RNA，利用cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒［寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司提供，takara］合 成cDNA，用 SPFMV、SPVG、SPVC、甘薯病毒2號(hào)（Sweet potato virus 2，SPV2）、SPCSV、SPMSV、黃瓜花葉病毒（Cucumber Mosaic Virus，CMV）、SPMMV、SPLV、甘薯褪綠斑病毒（Sweet potato chlorotic fleck virus，SPCFV）等10種病毒特異或兼并引物（表1）對(duì)樣品進(jìn)行 RT-PCR檢測(cè)，通過(guò)PCR SuperMix擴(kuò)增目的片段后回收產(chǎn)物，將回收產(chǎn)物連接到pMD19-T simple載體上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，利用菌液PCR鑒定，將陽(yáng)性克隆回收產(chǎn)物送生工生物（上海）有限公司測(cè)序，每個(gè)分離物選取3個(gè)重組子進(jìn)行序列測(cè)定，確定其核苷酸序列。

表 1 用于RT-PCR檢測(cè)病毒的引物

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和作圖。獲得的序列在NCBI上進(jìn)行BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/），下載相關(guān)序列，利用DNAMAN和SDT（http://web.cbio.uct.ac.za/～brejnev/）軟件來(lái)進(jìn)行序列比對(duì)，用MEGA 6.0軟件（http://www.megasoftware.net）中的最大簡(jiǎn)約法（Maximum likelihood，ML）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒檢測(cè)和種類(lèi)鑒定

將所采集到的病毒樣品嫁接到健康巴西牽牛植株上，巴西牽牛均發(fā)病，新生葉片產(chǎn)生皺縮、褪綠等癥狀。不同樣品的葉片癥狀不完全一致，說(shuō)明所有樣品均被病毒侵染，且病毒種類(lèi)不同。

用SPFMV、SPVG、SPVC、SPV-2、SPCSV、SPMSV、CMV、SPMMV、SPLV、SPCFV等10種病毒引物對(duì)采集的甘薯疑似染病的樣品進(jìn)行 RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示，所有的樣品均有檢測(cè)出病毒，但不同樣品侵染的病毒種類(lèi)不同。在所有樣品中，SPFMV檢出率最高，29個(gè)樣品中僅有4個(gè)樣品未檢測(cè)出該病毒，其余樣品檢測(cè)為陽(yáng)性，陽(yáng)性率為86.2%，每年的陽(yáng)性率相差不大，均在80%以上（圖1）。SPV2、SPVC和SPCSV陽(yáng) 性 率 均 在50%以上，SPVC在2016年的樣品檢測(cè)出陽(yáng)性率最高為83.3%，其余2個(gè)年份的陽(yáng)性率維持在43.0%左右；SPCSV出現(xiàn)逐年遞增的發(fā)生趨勢(shì)，2018年的陽(yáng)性率最高為81.3%；SPV2在2014年和2018年被檢測(cè)出，但2016年未檢測(cè)出陽(yáng)性樣品，而SPVC在2016年的檢測(cè)出陽(yáng)性率最高。SPVG和SPLV陽(yáng)性率最低，僅在2018年的樣品中出現(xiàn)1個(gè)陽(yáng)性，SPMMV和CMV也僅在2018年的樣品中檢測(cè)出陽(yáng)性。2014年SPCFV的陽(yáng)性率為28.6%，2016年增加到50%，但2018年未檢測(cè)到該病毒。

圖1 各年份及3年不同病毒檢測(cè)陽(yáng)性率

2.2 甘薯病毒病的復(fù)合侵染

病毒檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，江蘇地區(qū)甘薯病毒病的發(fā)生主要以3～5種病毒復(fù)合侵染為主，復(fù)合侵染率占比在62.1%，又以3種病毒病原復(fù)合侵染較為普遍，占復(fù)合侵染的29.2%。每年的甘薯病毒侵染的病毒種類(lèi)不同，2014年主要以SPFMV、SPVC和SPV2這3種病毒復(fù)合侵染為主，2016年以SPFMV、SPVC和SPCFV這3種病毒復(fù)合侵染為主， 2018年以SPCSV、SPFMV、SPV2、SPMMV及CMV等5種病毒復(fù)合侵染為主。

2.3 甘薯病毒系統(tǒng)進(jìn)化分析

擴(kuò)增馬鈴薯Y病毒屬病毒SPVC、SPV2和SPFMV病毒多聚蛋白基因的部分序列及SPCSV的部分cp基因序列，并進(jìn)行序列分析。結(jié)果表明，共獲得SPFMV江蘇分離物的基因序列，序列長(zhǎng)度為589 bp，包括有511 bp 的cp基因部分序列及78 bp非編碼區(qū)序列，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)后發(fā)現(xiàn)，SPFMV分離物分為2個(gè)組，Ⅰ組分離物屬于O株系，包括本研究的2個(gè)分離物，這些分離物與國(guó)內(nèi)分離物MK778789（O-shaan-17-5）和MK778790（O-su-17-10）分離物一致率最高，達(dá)94.1%～99.5%，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)上聚為一組；Ⅱ組包括O和RC株系分離物，本研究獲得的JS16-3分離物與O株系MK778792（O-wan-17-3）等分離物聚為一簇，JS15-1、JS18-5分離物與RC株系GU478326（R5）等分離物聚為一簇。SPVC獲得的片段長(zhǎng)度為836 bp，包括755 bp的部分cp基因序列和81 bp的非編碼區(qū)核苷酸序列，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)發(fā)現(xiàn)SPVC也分為2個(gè)明顯的組，其中JS18-41和JS18-64分離物與國(guó)內(nèi)分離物MK778817（gan-17-1）聚為一組，而其余分離物與韓國(guó)分離物KP115622（UN202）、中國(guó)分離物等MK778816（24-1）聚為一組。SPV2片段長(zhǎng)度368 bp，包括302 bp的cp基因序列和67 bp非編碼區(qū)，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)后也分為2個(gè)組，本研究獲得的3個(gè) 分 離 物JS18-113、JS18-111和JS18-43與MK778812（su-17-8）等分離物聚為一組，其余分離物與美國(guó)分離物KC962219 （SPV2-NC）聚為一組。SPCSV構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果表明：江蘇分離物在EA和WA組中均有分布，其中JS16-4與秘魯分離物HQ291260和國(guó)內(nèi)分離物HM773432等聚為一組，其余分離物與WA分離物聚為一組（圖2）。

圖2 利用ML法構(gòu)建不同病毒基因片段的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

3 小結(jié)與討論

目前對(duì)甘薯病毒病的檢測(cè)通常采用免疫學(xué)（ELISA）、電鏡觀察、分子生物學(xué)和指示植物。指示植物法是利用靈敏度高、易受病毒侵染和癥狀表現(xiàn)明顯的巴西牽牛，嫁接發(fā)病甘薯枝條10～20 d后，受病毒侵染的巴西牽牛基本上能表現(xiàn)癥狀。此方法相對(duì)免疫學(xué)和電鏡觀察具有簡(jiǎn)單易學(xué)、成本低、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，因此筆者采用嫁接巴西牽牛和分子生物學(xué)方法進(jìn)行病毒檢測(cè)。結(jié)果表明，嫁接的巴西牽牛均發(fā)病，所有的樣品均被病毒侵染，但是不同樣品的葉片癥狀不完全一致，說(shuō)明不同樣品所含有的病毒種類(lèi)不同，從而導(dǎo)致在巴西牽牛上產(chǎn)生的癥狀不完全相同。分子生物學(xué)檢測(cè)表明，甘薯病毒病種類(lèi)繁多，10種RNA病毒均被檢出，常見(jiàn)的主要有馬鈴薯Y病毒屬病毒SPFMV、SPV2、SPVC等及SPCSV。馬鈴薯Y病毒屬病毒與毛形病毒屬病毒SPCSV協(xié)同發(fā)生是云南、山東乃至全國(guó)、世界甘薯種植區(qū)近幾年發(fā)生危害比較嚴(yán)重的病害［6-8，17］，本研究結(jié)果也驗(yàn)證了這一結(jié)果。SPCSV在2016年和2018年的樣品中陽(yáng)性率高，同樣，SPMMV、SPMSV、SPLV和CMV等病毒也僅在2018年的樣品中檢測(cè)到陽(yáng)性，有2個(gè)原因造成這種情況：一是2014年樣品量少，二是這些病毒在江蘇可能處于剛擴(kuò)展趨勢(shì)，在生產(chǎn)上需引起重視。

甘薯病毒病發(fā)生的一個(gè)主要特點(diǎn)是多種病毒的復(fù)合侵染，從而引起更為嚴(yán)重的產(chǎn)量損失［20-22］。本研究明確，甘薯上RNA病毒復(fù)合侵染率達(dá)到62.1%，對(duì)單種病毒侵染的樣品并不排除有DNA病毒侵染的可能性，因此，實(shí)際上甘薯病毒病的復(fù)合侵染率會(huì)更高［23］。復(fù)合侵染主要以馬鈴薯Y病毒屬病毒與毛形病毒屬病毒SPCSV復(fù)合侵染為主，也是造成近幾年甘薯病毒病SPVD流行的主要原因。SPFMV是SPVD中的一個(gè)重要病毒，存在EA 、O和RC 這3個(gè)株系，在我國(guó)SPFMV的3種株系均有報(bào)道，本研究獲得的分離物存在O和RC 株系，其中O株系是江蘇的主流株系，未發(fā)現(xiàn)EA株系。SPVC是與SPFMV親緣進(jìn)化關(guān)系較近的一種病毒，與SPFMV一致率較高，在江蘇甘薯上大量存在，超過(guò)SPFMV-O株系，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)將其劃分為2個(gè)明顯的組，說(shuō)明馬鈴薯Y病毒屬病毒種群可能已經(jīng)產(chǎn)生新的變化［6］。SPV2系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，江蘇分離物也分為2個(gè)組，大部分分離物與美國(guó)分離物KC962219親緣關(guān)系較近，分為1個(gè)組中。SPCSV有2個(gè)株系，分別為EA株系和WA株系，這2種株系在我國(guó)均有報(bào)道，相對(duì)WA株系，EA株系在我國(guó)報(bào)道較早，但本研究獲得的江蘇分離物大部分屬于WA株系，可能WA株系分離物在江蘇分布區(qū)域較廣。

甘薯屬于無(wú)性繁殖材料，病毒能在薯苗和薯塊中積累，對(duì)甘薯田間病毒的檢測(cè)能預(yù)測(cè)第2年種苗質(zhì)量，從而可對(duì)病毒的發(fā)生提出預(yù)警，對(duì)病毒病的防治起著至關(guān)重要的作用。目前，江蘇省大田期甘薯病毒種類(lèi)繁多且協(xié)同發(fā)生嚴(yán)重，可導(dǎo)致病毒種群結(jié)構(gòu)的變化，增大防控難度，因此進(jìn)一步加強(qiáng)病毒檢測(cè)力度，規(guī)范引種和留種，可防止病毒的進(jìn)一步擴(kuò)散和發(fā)展。