基于模擬膀胱動態模型的導尿管源性ESBLs大腸埃希菌生物膜形成和細菌耐藥性分析

黃潤華,安 宇,劉 競,邱明星

(四川省醫學科學院·四川省人民醫院 a.手術室；b.泌尿外科，四川 成都610072)

導尿管相關性尿路感染(CAUTIs)的患者已經有相當大比例分離出產超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)的大腸埃希菌(E.coli)，其感染造成的嚴重不良事件或病死率逐年增高[1]。細菌生物膜(BF)是引起CAUTIs慢性反復致病和耐藥最重要機制[2]。ESBLs E.coli耐藥的主要機制是產生水解抗生素ESBLs。然而對于生物膜細菌而言，除了產酶機制外，細菌還可能再受到BF“保護”而產生更強或更持續的耐藥性。研究表明，尿源性大腸埃希菌和銅綠假單胞菌細菌生物膜菌株的耐藥率更高[3]。既往關于CAUTIs相關性ESBLs E.coli BF特點研究甚少，且均基于體外靜態BF孵育模型，BF形成能力與BF細菌耐藥之間有無相關性暫無報道。本研究將早期耐藥菌BF形成作為研究靶點，創新性地體外構建動態模擬膀胱細菌BF模型，在持續感染人工尿液環境下觀察BF形成特點和能力，了解BF不同表型(陰性或陽性)與BF細菌耐藥性的關系，旨在為臨床防治耐藥菌BF感染提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料2016年7月至2020年12月分離自我院門診部、急診部及住院部留置導尿管疑似感染送培養ESBLs E.coli報陽標本，編號E1～E46。標準菌株：E.coli 標準菌(ATCC25922)，編號E0；實驗菌株：CAUTIs相關性ESBLs E.coli臨床株；均由我院檢驗科提供并保存。主要試劑：M-H肉湯、M-H瓊脂，結晶紫溶液，人工尿液。主要儀器：VITEK2.0 COMPACT微生物分析儀，麥氏比濁儀，酶標儀，紫外分光光度計，智能型電熱恒溫培養箱，無菌工作臺，低溫冰箱，Nikon ECLIPSE Ti 倒置顯微鏡。

1.2 實驗方法

1.2.1細菌鑒定及藥敏實驗 標準菌株E0和實驗菌株E1～E46標本接種于血平皿，培養、純化，每組中取2個樣本，按操作流程上機檢測，鑒定為ESBLs E.coli，作11種泌尿外科常用抗生素藥敏分析。

1.2.2生物膜形成實驗 制備感染人工尿液：直接生長法將保種E0、E1～E46菌株活化、增菌獲得對數生長期的純種菌懸液，比濁法調節濁度值至0.5麥氏單位。配制無菌人工尿液[4]：以人工尿液 1∶100 稀釋菌懸液，獲得感染人工尿液。菌落數(1.0～2.0)×106CFU/ml。靜態BF模型：取12孔培養板，置入蓋玻片為載體，加入E1菌株感染人工尿液，每個樣本取5個復孔，靜置恒溫孵育48 h(37 ℃)，每12 h更新培養基。同法做E2～E46菌株BF形成實驗。動態BF模型[5]：組建灌流式膀胱細菌BF動態孵育模擬系統[6],于孵育盒內平整置入5張蓋玻片，接入動態孵育模擬系統，置入孵箱避光孵育48 h(37 ℃)，開啟蠕動泵持續泵入E1感染人工尿液，恒定流速約1.5 ml/min流轉。分別所獲蓋玻片，以1%結晶紫溶液室溫下染色，2個樣本送顯微鏡油鏡下鏡檢(10×100倍)，3個樣本以酶標儀測定OD630 nm值。實驗數值取平均OD值。同法做E2～E46菌株BF形成實驗。以上實驗均以無菌人工尿液作陰性對照，取平均OD值+3倍標準差為陰性界限OD值。E0 感染人工尿液作陽性對照。

1.3 結果判定[7]①BF形成陽性株：平均OD值>陰性界限OD值。弱陽性：平均OD值<2倍陰性界限OD值，強陽性：平均OD值>2倍陰性界限OD值。②BF形成陰性株：平均OD值<陰性界限OD值。

1.4 統計學方法應用SPSS 20.0統計學軟件分析數據。計量資料以均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析。計數資料比較采用連續性校正χ2檢驗或Fisher’s精確概率法。α=0.05

2 結果

2.1 藥敏實驗情況實驗菌株對碳青霉烯類抗生素和替加環素敏感率100%，對阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢替坦相對敏感(敏感率>75%)，對其余抗生素均呈現耐藥(敏感率<75%)。中介菌株視作耐藥菌株處置。見表1。

表1 實驗菌株藥敏結果[n(%)]

2.2 生物膜形成實驗情況靜態模型BF陽性率89.13%(41/46)，BF陰性率10.87%(5/46)。動態模型BF陽性率95.65%(44/46)，BF陰性率4.35%(2/46)。動態模型BF陽性株平均OD值顯著高于靜態模型(P<0.05)。見表2。動態模型試驗菌株BF形成結晶紫染色。見圖1。

表2 實驗菌株BF平均OD值

2.3 生物膜耐藥性分析實驗菌株靜態模型和動態模型BF不同表型(陽性或陰性)對11種抗菌藥物耐藥率進行分析，其耐藥性差異均無統計學意義(P>0.05)。見表3，表4。

表4 動態模型不同BF表型實驗菌株耐藥比較率 [n(%)]

3 討論

CAUTIs最主要的致病菌為腸桿菌科細菌，其中又以E.coli為首。隨著抗生素濫用日益嚴重，臨床已經分離出相當大比例的ESBLs E.coli。ESBLs E.coli對包括青霉素類、第三代頭孢菌素、單環酰胺類抗生素在內的幾乎所有的β-內酰胺類抗生素均耐藥[7]。CAUTIs慢性、持續、反復發生及防治困難的根源在于留置導尿管表面形成的BF，阻止致病菌BF形成或破壞已形成的BF是臨床防治CAUTIs的難點和熱點。

本研究顯示，全部臨床分離菌株均對碳青霉烯類抗生素和替加環素敏感，對其余包括左氧氟沙星在內泌尿外科常用抗生素均呈現相對較高的耐藥，且50%(23/46)的菌株呈現多重耐藥。據美國NHSN報告[8]，2011～2014年CAUTIs相關E.coli臨床分離株有10800株，其中35%對氟喹諾酮類藥物耐藥，16%對第三代頭孢菌素類藥物耐藥。氟喹諾酮類藥物對ESBLs E.coli的敏感性較低，是否仍然作為CAUTIs一線藥物值得思考。

BF是細菌為了生存，于介質表面以群體的方式包埋于胞外多聚物組成的基質網中，為自己構建了一個功能性的“保護傘系統”。BF是引起CAUTIs致病和致耐藥最為重要的原因。導尿管作為醫源性的植入物，一方面突破人體正常的生理防御機制增加了致病菌易感機會，另一方面作為異物成為BF的合適載體。BF所提供的保護性微環境與60%～85%的植入物體內病原菌感染有密不可分的關系[9]。

研究BF首先需要構建BF孵育系統。既往的BF研究大多基于體外靜態培養基，細菌在靜止培養條件下于介質表面形成BF，干預因素也相對簡單。然而生物體器官、組織及細胞均處于動態流體微環境中，如CAUTIs相關性BF細菌感染就處于膀胱及尿道的動態尿流環境中。與靜置條件培養相比，流加培養條件下全過程營養配給均衡充足，細菌生長代謝水平提高，細菌產物的產量增加。因此，構建更加符合人體膀胱尿流微環境，更好的模擬生理功能狀的“動態培養基”成為研究的關鍵環節。本研究創新性地組建灌流式膀胱細菌BF動態孵育模擬系統，較好地模擬了膀胱內尿液持續平衡流動環境，構建了ESBLs E.coli動態BF模型。本研究發現，ESBLs E.coli絕大多數具備BF形成能力，動態模型BF陽性率及形成能力均高于靜態模型，這表明本研究小組自行組建的動態模型較常規的靜態模型顯著地促進了BF形成，尤其在高BF產生菌株(即BF強陽性亞組)顯示了更大的優勢。這可能與動態模型提供持續的流體環境，細菌獲得適合的孔隙間距，營養物質均衡分布，菌落內水/營養物滲透更有利于BF細菌生長有關[10]。

本研究顯示，無論是靜態模型，還是動態模型，CAUTIs相關性ESBLs E.coli BF不同表型對抗生素的耐藥性均不存在差異。既往研究表明[11]，屎腸球菌臨床分離株BF形成能力更強，BF陽性株比陰性株對抗生素有更顯著的耐藥性，這可能與BF細菌產酶和BF特殊結構“雙重”耐藥性機制有關。此外，體外實驗證實BF細菌能被敏感抗生素清除的濃度，已超出抗生素在體內所能達到的極限值。因此，BF感染的防治策略亟需進一步探索和完善。

實驗存在的不足：①動態模型處于初步應用階段，尚不能完全模擬膀胱內環境。可能的改進措施包括：全系統密閉、避光設計，引入自動化數控模塊蠕動泵實現全自動化控制流速、流量，實現模擬膀胱容量變化等。②ESBLs E.coli BF形成能力與BF細菌耐藥分子機制等，課題小組將在進一步的實驗中探究和完善。