A2/O工藝活性污泥膨脹過程中菌群動態(tài)變化分析

康 虹 王洋洋 何葉霞 李佳怡 余紫婷 李 茜

延安大學(xué)石油工程與環(huán)境工程學(xué)院 陜西延安 716000

活性污泥法是目前國內(nèi)外應(yīng)用最廣泛的污水處理技術(shù)。厭氧-缺氧-好氧活性污泥工藝(Anaerbic-Anoxic-Oxic，A/O工藝)，交替運(yùn)行厭氧、缺氧、好氧三種環(huán)境條件以及不同種類的微生物的相互配合，具有污染物去除率高、耐沖擊負(fù)荷能力較強(qiáng)、總水力停留時(shí)間短、系統(tǒng)運(yùn)行穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，在城市生活污水處理中廣泛應(yīng)用。但活性污泥因各種環(huán)境因素變化而引發(fā)的污泥膨脹問題已成為制約該工藝發(fā)展的主要難題。

研究表明，超過90%的活性污泥膨脹都是由絲狀菌過度生長引起的，有必要對引起絲狀膨脹的優(yōu)勢種群進(jìn)行針對性研究，鑒定引起污泥膨脹的絲狀菌種類，分析引發(fā)污泥膨脹的影響因素。活性污泥微生物群落的組成及結(jié)構(gòu)對處理系統(tǒng)的效果及污泥的沉降性能均有較大影響。高通量測序技術(shù)分析結(jié)果準(zhǔn)確、快速并且靈敏度高、自動化程度高等特點(diǎn)，可全面檢測樣品中所含有的微生物，在海量數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上對微生物組成的種類和相對豐度進(jìn)行分析，所以在環(huán)境微生物鑒定領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛。

本研究以某城鎮(zhèn)污水處理廠A/O工藝中活性污泥微生物系統(tǒng)為研究對象，通過形態(tài)學(xué)鑒定主要絲狀菌種類、豐度并分析其變化趨勢；通過高通量測序，確定兩個(gè)時(shí)期的細(xì)菌種類及種群動態(tài)變化過程；通過對污水處理廠的實(shí)際運(yùn)行操作參數(shù)與菌群變化過程進(jìn)行相關(guān)分析，研究引發(fā)活性污泥膨脹的影響因素，為城市污水處理廠A/O工藝活性污泥膨脹的產(chǎn)生原因及有效治理措施提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 活性污泥采樣

從2021年1～5月期間，每月從某污水處理廠A/O工藝好氧段中采集400mL活性污泥混合液樣品。

1.2 顯微鏡鏡檢法

將50μL活性污泥混合液均勻地涂抹在載玻片上，置于顯微鏡(Olympus BX53)下100倍、200倍、400倍及1000倍油鏡視野下，觀察污泥絮體的大小及松緊程度、絲狀菌的種類、數(shù)量及生長發(fā)育狀況。根據(jù)絲狀菌形態(tài)學(xué)方法鑒定優(yōu)勢絲狀菌的種類并確定其豐度。

1.3 高通量測序法

用DNA試劑盒抽提所有活性污泥樣本基因組DNA。通過Illumina平臺測序獲知原始序列，將原始序列經(jīng)過濾處理后得到有效序列。測序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 活性污泥鏡檢分析

為了分析A/O工藝中活性污泥絮體結(jié)構(gòu)和優(yōu)勢絲狀菌的動態(tài)變化過程，對1～5月的活性污泥樣品進(jìn)行鏡檢，通過明場和染色后的鏡檢結(jié)果，分析污泥膨脹發(fā)生期和恢復(fù)期污泥絮體及優(yōu)勢絲狀菌的變化。

明場狀態(tài)下，可以看到污泥絮體的粒徑范圍為50～500μm。1～3月為活性污泥膨脹的發(fā)生期，通過鏡檢可以明顯地觀察到伸出污泥絮體外部的絲狀菌密度較高，且絮體松散，絮體粒徑大部分處于200μm以下的范圍；4～5月為活性污泥膨脹恢復(fù)期，作為絮體骨架的絲狀菌基本位于污泥絮體內(nèi)部，絮體結(jié)構(gòu)緊實(shí)且不易在外力作用下分散開來，污泥沉降性能良好。

通過鏡檢觀察到，在膨脹期，絲狀菌豐度為4～5，污泥絮體被內(nèi)部大量繁殖的絲狀菌撐破，結(jié)構(gòu)松散，沉降性能差。主要的優(yōu)勢絲狀菌為微絲菌(，以下簡稱)。

1月SVI為211mL/g，1月的優(yōu)勢絲狀菌為，其豐度為5，鏡檢視野中呈革蘭氏強(qiáng)陽性的絲狀菌普遍存在，這正是的顯著特征，絲狀菌內(nèi)部染色均勻且沒有出現(xiàn)斷裂或中空的情況證明其生長狀況良好。此外還觀察到大量的和極少量的，，Ι等絲狀菌，其豐度分別為3和1～2。

2～3月SVI分別為171mL/g、183mL/g，均大于150mL/g，此時(shí)處于污泥膨脹期，伸出活性污泥絮體表面的絲狀菌相比1月有所減少，污泥絮體的粒徑有所增大，絮體之間的緊密程度有所增加。2～3月的優(yōu)勢絲狀菌仍為，但豐度降低至4，仍觀察到大量的，豐度分別為2和3，其中2月觀察到了極少量的和；3月觀察到了極少量的和，豐度均為1～2。

當(dāng)溫度逐漸升高，的生長逐漸受到抑制，絲狀菌豐度逐漸降低，SVI也逐漸降低。通過鏡檢觀察到，活性污泥絮體粒徑逐漸增大，4～5月的絮體粒徑基本處于200～500μm范圍內(nèi)，絮體結(jié)構(gòu)逐漸緊實(shí)；由于絲狀菌競爭底物、營養(yǎng)物質(zhì)、溶解氧的優(yōu)勢減弱，且自身生長代謝受到抑制，游離在絮體外的絲狀菌出現(xiàn)斷裂或中空的現(xiàn)象，最終SVI恢復(fù)至正常水平。

4月的優(yōu)勢絲狀菌變?yōu)楹停S度均為3，伸出污泥絮體表面的絲狀菌較少，主要為和，其中對革蘭氏染色反應(yīng)是變化的，但通常是呈微弱的陽性，其最顯著的特征就是菌絲上有附著型生長，且細(xì)胞呈方形并有細(xì)胞間隔。此外還觀察到了極少量的和Ι，豐度均為1～2。

5月SVI降低至114mL/g，活性污泥恢復(fù)至正常水平，污泥生長狀態(tài)良好，伸出絮體邊界的絲狀菌極少。這一時(shí)期主要的優(yōu)勢絲狀菌仍為和，但豐度降低至2，在1000倍油鏡下還觀察到了極少量的和Ι，豐度均為1。

因此，可以確定為引發(fā)活性污泥膨脹的優(yōu)勢絲狀菌。

2.2 高通量測序結(jié)果分析

2.2.1 細(xì)菌群落多樣性分析

研究環(huán)境中微生物的多樣性，一般通過Alpha多樣性分析反映微生物群落的豐富度和多樣性，Coverage指數(shù)反映的是測序結(jié)果是否代表了樣本中微生物的真實(shí)情況，其數(shù)值越高，越能反應(yīng)樣本的真實(shí)性。Alpha的多樣性一般通過Simpson和Shannon這兩個(gè)多樣性指數(shù)來體現(xiàn)，Simpson指數(shù)越大，說明群落多樣性越低，Shannon指數(shù)值越大，說明群落多樣性越高。Chao值越大，表明微生物群落豐富度越高。

細(xì)菌的豐度和多樣性指數(shù)如表1所示，其中Sludge A代表1月份的樣品，Sludge B代表4月份的樣品。

表1 細(xì)菌的豐度和多樣性指數(shù)

由表1可知，細(xì)菌測序的有效序列在31876～46479之間，OTU數(shù)在951～1680之間。本次測序Coverage指數(shù)均在0.990以上，則說明測序結(jié)果能較真實(shí)地反映樣品中微生物的組成情況。根據(jù)Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)可以看出4月份的活性污泥樣品中細(xì)菌群落多樣性比1月份高，污泥膨脹恢復(fù)后，活性污泥中細(xì)菌群落多樣性增加。由Chao值可知，污泥膨脹時(shí)，細(xì)菌群落豐富度較低，膨脹慢慢恢復(fù)，群落豐富度也逐漸上升。

2.2.2 細(xì)菌群落組成

樣本測序共得到36個(gè)細(xì)菌門，其中相對豐度在1%以上的門類有11個(gè)。根據(jù)測序結(jié)果，樣本中最主要的細(xì)菌門是變形菌門()，相對豐度為32.64%～33.76%。變形菌門作為傳統(tǒng)活性污泥法工藝中的優(yōu)勢種群，在污水處理中具有去除有機(jī)物、脫氮除磷的功能。除此外放線菌門()、擬桿菌門()、酸桿菌門()、綠彎菌門()也是主要的門，其相對豐度分別為18.89%～22.67%、4.12%～25.85%、1.76%～20.53%、5.61%～10.47%。在污泥膨脹發(fā)生期擬桿菌門、酸桿菌門、綠彎菌門的相對豐度分別為25.85%、1.76%、5.61%，當(dāng)膨脹慢慢恢復(fù)，4月份的活性污泥樣品中擬桿菌門的相對豐度降至4.12%，而酸桿菌門大量繁殖，相對豐度增加到20.53%，綠彎菌門的相對豐度也增加至10.47%。此外，還發(fā)現(xiàn)了一些至少在一個(gè)樣品中相對豐度大于1%的細(xì)菌門，如芽單胞菌門()(046～136)、疣微菌門()(047～122)、浮霉菌門()(071～152)、厚壁菌門()(120～543)、(1.53%～3.00%)。

樣本測序共得到716個(gè)屬，至少在一個(gè)污泥樣本中相對豐度大于1%的細(xì)菌屬共有35個(gè)。其中，腐螺旋菌屬(__)、微絲菌屬(_)是污泥膨脹發(fā)生期的優(yōu)勢菌屬，其相對豐度分別為1358、1255。此外還發(fā)現(xiàn)了少量的黃桿菌屬()、四球蟲屬()，相對豐度分別為119、151。在污泥膨脹恢復(fù)期，腐螺旋菌屬(__)、微絲菌屬(_)、黃桿菌屬()以及四球蟲屬()均未發(fā)現(xiàn)，此時(shí)的優(yōu)勢菌屬變?yōu)镽B41、鏈霉菌屬()，其相對豐度分別為984、572、481。在膨脹的發(fā)生期，腐螺旋菌屬(__)和微絲菌屬(_)處于優(yōu)勢地位。隨著膨脹慢慢恢復(fù)，微絲菌屬(_)因溫度的影響其生長受到顯著抑制，以鏈霉菌屬()為代表的放線菌得以生長，因而膨脹恢復(fù)期放線菌門()的相對豐度略高于膨脹發(fā)生期，但鏈霉菌屬()相對豐度小于微絲菌屬(_)。結(jié)合鏡檢結(jié)果，此時(shí)絲狀菌多存在于絮體內(nèi)部作為骨架支撐，使得絮體形成較大粒徑的密實(shí)結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)為SVI逐漸下降至150mL/g以下，活性污泥從膨脹期恢復(fù)。

腐螺旋菌屬(__)隨污泥膨脹恢復(fù)而消失，因此擬桿菌門的相對豐度在膨脹恢復(fù)期顯著下降。RB41在膨脹恢復(fù)期處于優(yōu)勢地位，因而酸桿菌門的相對豐度顯著增高。研究表明，腐螺旋菌屬(__)、黃桿菌屬()會引起絲狀菌污泥膨脹。微絲菌屬(_)、四球蟲屬()也是能引起污泥膨脹的細(xì)菌屬。

在污泥膨脹發(fā)生期，處于優(yōu)勢地位的細(xì)菌種為微絲菌(_)，綜合屬水平和種水平的結(jié)果，可以確認(rèn)引起工藝污泥膨脹的主要菌群為微絲菌(_)，高通量測序結(jié)果與鏡檢結(jié)果一致。

2.3 運(yùn)行參數(shù)分析

是一種微氧菌，在厭氧、缺氧、好氧三種不同的環(huán)境條件下均具有較強(qiáng)的底物儲存能力，與其他微生物種群相比，這一特點(diǎn)使得微絲菌具有強(qiáng)大的競爭優(yōu)勢。微絲菌細(xì)胞表面呈疏水性，有水解脂肪酶的存在，因此其具有吸收并利用脂肪類物質(zhì)(尤其是長鏈脂肪酸)的能力。采用油酸作為碳源的批量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，厭氧-好氧交替工藝有利于微絲菌在活性污泥中維持較高豐度。微絲菌可以在厭氧和缺氧條件下能夠吸收長鏈脂肪酸，營養(yǎng)物質(zhì)在厭氧區(qū)得到儲存并在好氧區(qū)得到利用，因而，在厭氧、缺氧、好氧交替運(yùn)行的工藝中有顯著競爭優(yōu)勢。A/O工藝采用的正是厭氧、缺氧、好氧的工藝流程，因此活性污泥在這三種環(huán)境條件間交替流動的過程中極易促進(jìn)微絲菌的增殖，從而引發(fā)污泥膨脹。

為了進(jìn)一步研究引起活性污泥膨脹的影響因素，對A/O工藝好氧段1～5月的溫度、SVI以及實(shí)際運(yùn)行操作參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。工藝運(yùn)行的1～5月期間，污染物去除的效率較高，COD、NH-N出水濃度隨進(jìn)水濃度的波動幅度較小且基本維持穩(wěn)定。COD平均去除率達(dá)93.7%，NH-N平均去除率達(dá)96.1%，TN、TP的平均去除率分別為78.2%、98.7%。污泥膨脹發(fā)生期(1～3月)與膨脹恢復(fù)期(4～5月)COD、NH-N、TN、TP的出水濃度均能穩(wěn)定達(dá)到出水標(biāo)準(zhǔn)。

溫度是影響活性污泥微生物生理功能的關(guān)鍵因素，活性污泥中脫氮除磷的主要菌群的生理活動會隨著溫度的升高而增加。研究表明，溫度對微絲菌的生長存在較大的影響，F(xiàn)AN等發(fā)現(xiàn)低溫(13℃)更有利于維持活性污泥中絲狀菌的優(yōu)勢地位。通過相關(guān)性分析，SVI與C/N、T、F/M均呈負(fù)相關(guān)，其中SVI與溫度呈顯著負(fù)相關(guān)(P值<0.01)，可以認(rèn)為溫度是導(dǎo)致污泥膨脹發(fā)生的主要影響因素。溫度與SVI呈顯著負(fù)相關(guān)，即隨著溫度的降低，活性污泥中SVI呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢。1月SVI值為211mL/g，正處于活性污泥膨脹的嚴(yán)重期，隨著溫度的升高，SVI不斷降低，最終降至114mL/g，恢復(fù)至正常水平。

結(jié)語

通過對城市污水處理廠A/O工藝活性污泥膨脹的發(fā)生期和膨脹恢復(fù)期兩個(gè)時(shí)期的跟蹤研究，應(yīng)用顯微鏡形態(tài)學(xué)鑒定以及高通量測序的方法，分析活性污泥種群動態(tài)變化、污泥膨脹過程中優(yōu)勢絲狀菌的變化，對溫度、污水處理廠實(shí)際運(yùn)行操作參數(shù)與SVI進(jìn)行相關(guān)性分析，對污泥膨脹的發(fā)生及其影響因素進(jìn)行探討研究，得出如下結(jié)論：

(1)在污泥膨脹的發(fā)生期即1～3月，絲狀菌大量繁殖，過多菌絲伸出絮體表面，撐破絮體，導(dǎo)致污泥絮體結(jié)構(gòu)松散，粒徑基本處于200μm以下，通過鏡檢結(jié)果確定微絲菌()為引發(fā)污泥膨脹的優(yōu)勢絲狀菌；在污泥膨脹的恢復(fù)期即4～5月，作為絮體骨架的絲狀菌基本處于污泥絮體內(nèi)部，活性污泥結(jié)構(gòu)緊實(shí)且不易分散，污泥沉降性能良好。

(2)從細(xì)菌群落門水平上來看，從膨脹發(fā)生期到膨脹恢復(fù)期活性污泥細(xì)菌群落的豐度和多樣性均增加，活性污泥生態(tài)系統(tǒng)逐漸恢復(fù)；綜合屬水平和種水平的測序結(jié)果，確定微絲菌屬(_)為引發(fā)污泥膨脹的主要種群，高通量測序結(jié)果與鏡檢結(jié)果一致。

(3)A/O工藝的厭氧、好氧交替條件為微絲菌提供了優(yōu)良的生長環(huán)境，通過分析工藝的SVI與C/N、T、F/M等運(yùn)行參數(shù)的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)SVI與溫度呈顯著負(fù)相關(guān)，又因微絲菌()是嗜低溫菌，則可以考慮工藝條件和溫度變化共同導(dǎo)致系統(tǒng)發(fā)生污泥膨脹。