miR-328、ITGα5在乳腺癌中的表達(dá)及與臨床病理特征、預(yù)后的關(guān)系

李建梅，孫靜宜，馬英橋，趙 月

隨著分子生物學(xué)發(fā)展，從分子機(jī)制了解腫瘤的發(fā)生、分化、增殖、浸潤(rùn)等成為目前腫瘤基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn)[1]。miR-328可減少細(xì)胞黏附、遷移及聚集，可調(diào)控毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)形成[2]。以往有研究發(fā)現(xiàn)，miR-328在多種腫瘤包括乳腺癌中表達(dá)明顯下調(diào)，提示miR-328為乳腺癌抑制性微小RNA[3]。腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移是因宿主和腫瘤之間一系列特異作用所致。整合素在腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間出現(xiàn)的一系列相互作用中發(fā)揮著重要作用，整合素細(xì)胞外基質(zhì)分子的細(xì)胞黏附受體可與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白相互作用，從而介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移[4]。有生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，蛋白整合素α5(ITGα5)是miR-328的靶點(diǎn)，而ITGα5水平升高對(duì)PI3K/AKT通路的激活也有重要作用[5]。因此我們推測(cè)，miR-328可能通過(guò)靶向ITGα5調(diào)節(jié)PI3K/AKT通路活性，對(duì)乳腺癌干細(xì)胞的分化、形成和轉(zhuǎn)移具有重要影響。本研究旨在探索miR-328、ITGα5在乳腺癌中的表達(dá)及與臨床病理特征、預(yù)后的關(guān)系，以期為乳腺癌的靶向治療提供新的策略。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2016年3月—2020年3月我院收治的乳腺癌317例，年齡≥60歲149例，<60歲168例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：有148例，無(wú)169例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期172例，Ⅲ～Ⅳ期145例；腫瘤直徑：≥2 cm 185例，<2 cm 132例；雌激素受體(ER)陽(yáng)性160例，孕激素受體(PR)陽(yáng)性174例。納入標(biāo)準(zhǔn)：均經(jīng)病理檢查證實(shí)為乳腺癌患者；在術(shù)前均未進(jìn)行放療或化療；患者及家屬均簽署知情同意書；臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：存在血液系統(tǒng)或免疫系統(tǒng)疾病者；合并心、肝、腎等嚴(yán)重原發(fā)性疾病者；合并其他部位腫瘤者。

1.2miR-328、ITGα5檢查方法 miR-328：入院后抽取患者靜脈血液2 ml，使用密度梯度離心法分離患者外周血單個(gè)核細(xì)胞，用于提取RNA，并使用特異引物對(duì)miRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，隨后使用熒光定量PCR反應(yīng)檢測(cè)。ITGα5檢查：取病理標(biāo)本，使用4%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，行4 μm厚連續(xù)切片，用于免疫組織化學(xué)SP染色和HE染色。由美國(guó)Cymbus Biotechnology公司提供ITGα5檢測(cè)試劑盒。具體實(shí)驗(yàn)步驟根據(jù)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。切片染色均使用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照為染色陽(yáng)性切片。結(jié)果判定：由2名經(jīng)驗(yàn)豐富病理科醫(yī)生在雙盲情況下對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定，ITGα5陽(yáng)性表達(dá)為細(xì)胞膜或胞質(zhì)內(nèi)有棕色顆粒。在高倍鏡(×400)下隨機(jī)選擇5個(gè)視野對(duì)切片進(jìn)行觀察，每個(gè)視野200個(gè)細(xì)胞，一共計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞。根據(jù)腫瘤細(xì)胞著色情況進(jìn)行判定：Ⅰ為無(wú)反應(yīng)或微弱反應(yīng)、Ⅱ?yàn)樽厣ⅱ鬄樯钭厣?jì)算染色情況為Ⅱ、Ⅲ的5個(gè)高倍鏡視野中陽(yáng)性染色細(xì)胞的百分率，Ⅰ及陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤75%為低表達(dá)，>75%則為高表達(dá)[6]。

1.3觀察指標(biāo) 對(duì)比癌組織及癌旁正常組織(距腫瘤切緣≥0.5 cm)中miR-328、ITGα5表達(dá)水平。分析miR-328與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系。分析ITGα5與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系及miR-328、ITGα5與乳腺癌預(yù)后的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1患者1年后生存情況 317例1年后生存285例，死亡32例，病死率為10.09%。

2.2不同組織中miR-328、ITGα5表達(dá)水平比較 癌組織及癌旁正常組織miR-328表達(dá)水平分別為5.124±1.159和6.854±1.718。癌組織miR-328表達(dá)水平低于癌旁正常組織(P<0.01)。癌組織及癌旁正常組織ITGα5高表達(dá)分別為175例(55.21%)和83例(26.18%)。癌組織ITGα5高表達(dá)率高于癌旁正常組織(P<0.01)。

2.3miR-328與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系 miR-328在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑方面比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，在年齡、TNM分期及ER、PR表達(dá)方面比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 miR-328與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系

2.4ITGα5高表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系 ITGα5高表達(dá)在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期方面比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，在年齡、腫瘤直徑及ER、PR表達(dá)方面比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 ITGα5高表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系(例)

2.5乳腺癌患者預(yù)后危險(xiǎn)因素分析 經(jīng)多因素Logistic回歸分析可知，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、miR-328低表達(dá)、ITGα5高表達(dá)為乳腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.01)。見表3。

表3 乳腺癌患者預(yù)后危險(xiǎn)因素分析

3 討論

腫瘤干細(xì)胞的功能受多種因素調(diào)控，如基因和表觀遺傳改變等。近年來(lái)，miRNAs作為一種非編碼短鏈RNA，在腫瘤干細(xì)胞中的作用日趨凸顯[7]。miRNAs也是乳腺癌的重要調(diào)節(jié)因子，miRNAs表達(dá)改變與乳腺癌的發(fā)生密切相關(guān)[8]。miR-328對(duì)肝細(xì)胞癌變和慢性髓系白血病有抑制作用，通過(guò)將miRNA進(jìn)行列陣分析發(fā)現(xiàn)，miR-328對(duì)靶基因ABCG2和MMP-16具有直接的作用，可影響mRNA水平及SP細(xì)胞蛋白表達(dá)，從而達(dá)到抑制癌癥發(fā)生及進(jìn)展的目的[9]。以往研究發(fā)現(xiàn)，miR-328對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤內(nèi)的U87增殖有抑制作用，可延長(zhǎng)患者生存期，也是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤預(yù)后評(píng)估的有效指標(biāo)[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-328在乳腺癌組織中表達(dá)水平低于癌旁正常組織，且腫瘤直徑越大、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者miR-328表達(dá)水平越低，且是乳腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示miR-328是乳腺癌的保護(hù)基因，其表達(dá)水平越低，患者預(yù)后情況越差，與既往文獻(xiàn)結(jié)果相符[11]。

ITGα5是整合素家族的重要成員，可與整合素β1(ITGβ1)結(jié)合形成二聚體，是基質(zhì)重要成分纖連蛋白的受體。腫瘤細(xì)胞表達(dá)的亞基經(jīng)過(guò)與宿主間質(zhì)細(xì)胞纖連蛋白結(jié)合后可影響腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲狀態(tài)[12]。有研究顯示，ITGα5高表達(dá)為肺癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期越高、預(yù)后不良患者中表達(dá)明顯上調(diào)，提示腫瘤細(xì)胞經(jīng)整合素介導(dǎo)，通過(guò)改變細(xì)胞外基質(zhì)黏附能力從而間接或直接調(diào)控腫瘤細(xì)胞的侵襲能力，從側(cè)面證明ITGα5與腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[13]。ZHU等[14]從DNA、蛋白水平證明ITGα5有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和增殖的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，ITGα5在乳腺癌組織中高表達(dá)，在癌旁正常組織中低表達(dá)，可能是因?yàn)榛蛘{(diào)節(jié)機(jī)制[15]；且進(jìn)一步分析ITGα5表達(dá)情況與乳腺癌患者臨床病理特征間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，ITGα5表達(dá)情況與乳腺癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者、TNM分期越高者ITGα5表達(dá)水平越高，提示通過(guò)調(diào)節(jié)ITGα5表達(dá)可影響腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。

生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)ITGα5是miR-328的靶點(diǎn)，而ITGα5水平升高對(duì)PI3K/AKT通路激活也有重要作用[16]。我們推測(cè)，miR-328-5p可能通過(guò)靶向ITGα5調(diào)節(jié)PI3K/AKT通路活性，對(duì)乳腺癌干細(xì)胞的分化、形成和轉(zhuǎn)移具有重要影響[17]。通過(guò)預(yù)后危險(xiǎn)因素分析可知，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、miR-328低表達(dá)、ITGα5高表達(dá)為乳腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示miR-328、ITGα5可作為乳腺癌惡性程度、預(yù)后評(píng)估的重要參考指標(biāo)[18]。

綜上所述，miR-328為乳腺癌保護(hù)基因，在乳腺癌中表達(dá)下調(diào)，ITGα5表達(dá)上調(diào)，二者與患者臨床病理特征及預(yù)后密切相關(guān)。術(shù)后關(guān)注乳腺癌患者miR-328、ITGα5表達(dá)情況可有助于評(píng)估腫瘤生物學(xué)行為，對(duì)患者術(shù)后復(fù)發(fā)、預(yù)后評(píng)估及治療方案選擇有重要的參考價(jià)值。