血清LncRNA MEG3、miR-141表達在類風濕關節炎診斷評估中的價值及與IL-6、TNF-α、RF、CRP的相關性

劉媛媛，李洪春

類風濕關節炎是一種慢性系統性自身免疫性疾病，臨床主要表現為手、足小關節等多發性關節炎，可致患者關節疼痛、損傷甚至功能喪失，嚴重影響患者生活質量[1]。劉振峰等[2]研究表明，骨性關節炎患者軟骨組織中長鏈非編碼RNA母系表達基因3(LncRNA MEG3)表達降低，其降低程度與軟骨退化程度升高關系密切。LI等[3]發現，LncRNA MEG3通過靶向調控炎性因子表達，從而在強直性脊柱炎中發揮重要作用。胡玲等[4]研究指出，在骨性關節炎模型大鼠脊髓背角神經細胞中微小RNA-141(miR-141)表達升高，并且其升高與模型小鼠關節疼痛程度呈正相關。WANG等[5]研究報道，在結直腸癌化療耐藥進展中，miR-141與LncRNA MEG3存在一定的調控關系。但關于miR-141與LncRNA MEG3在類風濕關節炎中的作用及關系目前尚不清楚。在類風濕關節炎發生發展過程中，炎性因子介導的炎癥反應起著重要作用[6]。白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、C反應蛋白(CRP)為機體重要的炎癥反應標志物，三者在類風濕關節炎患者中明顯升高，且其升高程度提示疾病活動程度[7-9]。類風濕因子(RF)是一種以變性IgG為靶抗原的自身抗體，目前廣泛應用于類風濕關節炎的診斷[10-11]。本研究通過檢測類風濕關節炎患者和體檢健康者血清LncRNA MEG3、miR-141表達及IL-6、TNF-α、RF、CRP水平，探究血清LncRNA MEG3、miR-141表達在類風濕關節炎診斷評估中的價值及與IL-6、TNF-α、RF、CRP的相關性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年1月—2021年12月贛榆區人民醫院收治的類風濕關節炎40例，其中男4例，女36例；年齡28～59(47.12±9.45)歲；病程0.5～3.2(2.16±0.25)年。①納入標準：均符合類風濕關節炎的診斷標準[12]；臨床資料完整。②排除標準：伴其他自身免疫性疾病、高血壓病、糖尿病、感染性疾病、精神疾病及肝、腎功能障礙性疾病者；臨床資料欠缺者。另選取同期正常體檢的健康者40例作為對照組，其中男5例，女35例；年齡26～60(47.55±8.46)歲。2組性別、年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2主要試劑及儀器 RNA提取試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司;實時熒光定量PCR(qRT-PCR)試劑盒、逆轉錄試劑盒均購自賽默飛世爾科技有限公司；IL-6、TNF-α酶聯免疫吸附試驗試劑盒均購自上海酶聯生物科技有限公司。

1.3研究方法

1.3.1樣本采集：觀察組于來院后第2日采集空腹外周血5 ml，對照組體檢時采集空腹外周血5 ml，3000 r/min離心5 min，分離血清，置于-80 ℃環境中保存待檢。

1.3.2血清LncRNA MEG3、miR-141表達檢測：采用qRT-PCR法檢測血清LncRNA MEG3、miR-141表達水平。取血清樣本加入RNA提取試劑提取總RNA。逆轉錄RNA，獲得cDNA。行qRT-PCR檢測，20 μl反應體系：cDNA 2 μl，Mix 10 μl，ROX 0.4 μl，上、下游引物各2 μl，DEPC水3.6 μl。將反應體系按如下步驟進行反應：95 ℃ 7 min，1個循環；95 ℃ 15 s，62 ℃ 32 s，73 ℃ 15 s，40個循環。LncRNA MEG3以GAPDH為內參基因，miR-141以U6為內參基因，采用2-ΔΔCt法計算血清LncRNA MEG3、miR-141相對表達量。qRT-PCR引物序列:LncRNA MEG3 上游引物:5'-GGGCTTCTGGAATGAGCATGCTACTG-3',下游引物:5'-ACATTCGAGGTCCCCTTCCCACGTAGGCATC-3';miR-141 上游引物:5'-GCCTGTAGCTTTTCCTACT-3',下游引物:5'-CACGGCGGTTCGTCGAGT-3';GAPDH 上游引物:5'-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3',下游引物:5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3';U6 上游引物:5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3',下游引物:5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。

1.3.3血清IL-6、TNF-α、RF、CRP水平檢測：采用酶聯免疫吸附試驗檢測2組血清IL-6、TNF-α水平，采用免疫比濁法檢測血清RF、CRP水平，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

2 結果

2.1血清LncRNA MEG3、miR-141表達水平比較 觀察組血清LncRNA MEG3表達水平明顯低于對照組，miR-141表達水平明顯高于對照組(P<0.01)。見表1。

表1 2組血清LncRNA MEG3、miR-141表達水平比較

2.2血清IL-6、TNF-α、RF、CRP水平比較 觀察組血清IL-6、TNF-α、RF、CRP水平均高于對照組(P<0.01)。見表2。

表2 2組血清IL-6、TNF-α、RF、CRP水平比較

2.3血清LncRNA MEG3、miR-141表達與IL-6、TNF-α、RF、CRP水平的相關性 觀察組血清LncRNA MEG3表達與IL-6、TNF-α、RF、CRP水平呈顯著負相關(P<0.01)，血清miR-141表達與IL-6、TNF-α、RF、CRP水平呈正相關(P<0.01)。見表3。

表3 類風濕關節炎患者血清LncRNA MEG3、miR-141表達與IL-6、TNF-α、RF、CRP水平的相關性

2.4血清LncRNA MEG3、miR-141對類風濕關節炎的診斷效能 血清LncRNA MEG3診斷類風濕關節炎的曲線下面積為0.812(95%CI：0.733，0.866)，當LncRNA MEG3取最佳截斷值0.81時，診斷敏感度為77.00%，特異度為71.30%；血清miR-141診斷類風濕關節炎的曲線下面積為0.834(95%CI：0.786，0.857)，當miR-141取最佳截斷值1.82時，診斷敏感度為75.70%，特異度為84.20%；二者聯合診斷類風濕關節炎的曲線下面積為0.876(95%CI：0.831，0.912)，診斷敏感度為88.91%，特異度為80.14%。見圖1。

圖1 血清LncRNA MEG3、miR-141診斷類風濕關節炎的ROC曲線

3 討論

類風濕關節炎患者多累及手、足、腕、膝關節等部位，出現腫脹、畸形、脫位等癥狀，若累及其他器官可出現心肌炎、冠狀動脈炎、皮膚潰瘍、間質性腎炎等表現，嚴重影響患者的身體健康[13-15]。目前，類風濕關節炎的發生機制不明，馬武開等[16]認為，本病發生與T淋巴細胞及巨噬細胞釋放大量炎性因子引起骨關節破壞有關。

CHEN等[17]研究發現，LncRNA MEG3通過調控骨關節炎患者軟骨細胞增殖、凋亡、細胞外基質降解和炎癥反應程度在疾病發生發展過程中起重要作用，其表達水平明顯降低。LI等[18]在一項動物實驗中指出，LncRNA MEG3可減少肺部感染模型小鼠炎性因子產生。TONG等[19]在高糖誘導的糖尿病視網膜病變模型中發現，通過抑制LncRNA MEG3表達可促進TNF-α、IL-6等炎性因子分泌，加重疾病進程。LI等[20]研究顯示，在骨關節炎兔模型中LncRNA MEG3過表達可降低TNF-α、IL-6水平，從而緩解模型兔疼痛和炎癥反應程度。TIAN等[21]研究發現，在股骨頭壞死模型小鼠骨組織中miR-141呈高表達，當干預其表達使之降低后模型小鼠成骨細胞活性明顯改善，提示干預miR-141表達可延緩股骨頭壞死疾病進展。

IL-6和TNF-α是類風濕關節炎重要的炎癥反應標志物，其水平與疾病程度呈正相關[22-25]。IL-6通過促使胸腺細胞及T細胞分化為細胞毒性T細胞參與類風濕關節炎發病，與本病發生密不可分，還可通過促進B細胞成熟分泌RF抗體，及促進滑膜成纖維細胞增生導致關節受損[26]。TNF-α是類風濕關節炎發病重要的促炎細胞因子，由單核細胞、巨噬細胞、自然殺傷細胞、T細胞、B細胞等分泌，可誘導內皮細胞黏附分子表達，促進白細胞與血管內皮黏附滲透導致局部炎癥反應，促進成纖維細胞、內皮細胞及滑膜細胞等細胞生長因子釋放，促進膠原降解、骨質破壞及軟骨損傷[27]。RF是臨床診斷類風濕關節炎最常用的實驗室指標，陽性檢出率為50%～90%，但在系統性紅斑狼瘡、系統性硬化病、多發性心肌炎等其他免疫性疾病中常呈陽性，加之某些健康者中也會呈現陽性，故臨床醫生通常用于類風濕關節炎的輔助診斷，不宜單獨應用。CRP是肝臟合成的急性時相反應蛋白，雖然反映類風濕關節炎患者炎癥反應程度及病情的效果不是很好，但卻可通過檢測其陽性表達預測是否為類風濕關節炎所引起的炎癥反應，故可作為類風濕關節炎較好的輔助檢查指標。本研究顯示，觀察組血清LncRNA MEG3表達明顯低于對照組，血清miR-141表達明顯高于對照組，血清IL-6、TNF-α、RF、CRP水平高于對照組，且觀察組血清LncRNA MEG3表達與IL-6、TNF-α、RF、CRP水平均呈負相關，血清miR-141表達與IL-6、TNF-α、RF、CRP水平均呈正相關。提示LncRNA MEG3、miR-141可能通過調控上述炎性因子表達水平，影響類風濕關節炎的發生發展進程。

本研究還發現，血清LncRNA MEG3、miR-141聯合檢測診斷類風濕關節炎的曲線下面積為0.876，敏感度為88.91%，特異度為80.14%，二者聯合診斷類風濕關節炎的效能高于單一診斷。提示血清LncRNA MEG3、miR-141聯合檢測對類風濕關節炎的診斷價值較高。

綜上所述，類風濕關節炎患者血清LncRNA MEG3表達降低、miR-141表達升高，且與IL-6、TNF-α、RF、CRP水平具有顯著相關性，二者可能通過調控上述炎性因子表達參與疾病的發生發展進程，且二者聯合檢測對類風濕關節炎的診斷效能較高。