尿毒癥大鼠肌少癥模型的造模方法及評價

吳永耀，余日臻，孫京華，閆迎華，張豪杰，劉江，裘曉蕙

肌少癥是一種隨年齡增長而發生的骨骼肌下降，以骨骼肌質量、力量及功能降低為主要特征的退行性綜合征[1]。臨床表現為肌力減退，日常活動受限，易致跌倒骨折發生，大大增加死亡風險[2]。與增齡相關的肌少癥相比，尿毒癥伴隨肌少癥臨床預后更差，死亡率更高[3]。因此，建立尿毒癥肌少癥的動物模型就顯得十分重要。慢性限制性應急，是一種慢性制動聯合禁食的造模方法，是廣泛被運用到情志動物模型的制作[4]，結合尿毒癥患病后的臨床特點[5]，對尿毒癥大鼠進行慢性限制，更加接近尿毒癥患者病后的一般狀態，從肌少癥病因學的多角度進行干預。為此，筆者擬在5/6腎臟切除尿毒癥動物模型基礎上聯合慢性限制性應急，建立尿毒癥肌少癥動物模型，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 選取18個月齡雄性中老年大白鼠35只，體質量305～317 g，由寧波大學實驗動物中心提供，飼料喂養3 d適應環境后造模。

1.2 動物模型的建立

1.2.1 慢性腎功能衰竭模型制造25只大鼠按經典的兩步法行5/6腎切除術，一期手術切除約左腎體積的5/6；1周后，二期手術切除右側腎臟。二期手術后4周，達到尿毒癥診斷標準的有20只，隨機分成兩組：5/6腎切除組（尿毒癥組，=10），5/6腎切除+慢性限制性活動組（造模組，=10）。余下10只大鼠為假手術組（對照組，=10），采用2次手術法，手術僅打開腎包膜，暴露腎臟約5 min后縫合肌層及皮膚。3組大鼠術后分籠飼養于室溫18～25℃通風良好的環境中，正常飲食喂養4周，自由進食、飲水。

1.2.2 肌少癥模型制造（尿毒癥聯合慢性限制性應急）將尿毒癥大鼠置于束縛制動筒內，通過移動插片逐步縮小大鼠的活動空間，調節到其不產生強烈反抗的程度，每天束縛制動1次，第1天為4 h，其后根據大鼠一般情況適當增減，期間監測一般情況、體質量變化，連續16周。造模大鼠在制動期間禁食、不禁水（圖1）。肌少癥診斷標準參照Baumgartner等[6]的方法，模型組SI值與對照組相比顯著降低，且差異大于2倍SD判定模型成功。SI值定義為靶骨骼肌的質量（mg）/受試體質量（g）求得的值。本研究以腓腸肌作為靶肌肉，使用SI作為評價指標來判斷肌肉減少癥動物模型成功與否。

圖1 尿毒癥聯合慢性限制性造模法

1.3 前肢抓力測量 將大鼠前肢平放在電子抓力儀的感應桿上，當大鼠牢牢抓住感應桿后，平行拖拽大鼠尾巴，直到松開為止，抓力儀會自動記錄大鼠的最大抓力。重復測量3次，取最大值為大鼠的抓力，每2周測量1次。

1.4 觀察指標 實驗期間每天觀察大鼠的一般情況，包括外形、精神狀態及食欲等。體質量指標檢測每2周稱重1次。

1.5 腓腸肌組織及血液標本的留取在16周末對3組大鼠進行取材，處死大鼠后，取大鼠腓腸肌稱重，計算SI比值，并行HE染色法在400倍下拍照獲得圖像。用Image pro 6.0軟件對切片圖像進行分析，測量細胞的平均橫截面積。

1.6 統計方法 采用SPSS 11.5統計軟件進行統計學分析。計量數據以均數±標準差表示，多組比較采用重復測量數據的方差分析，多重比較采用SNK檢驗。＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠一般情況 實驗期間共有3個大鼠死亡（均在行5/6腎臟切除術后），經尸體解剖檢查，考慮為術后止血不徹底及合并腹腔感染所致。二期5/6腎切除初期，大鼠活動量明顯減少，體質量下降，4周后體質量趨于穩定。造模組初期，大鼠出束縛制動筒后處于易激惹狀態，而后期出現活動及飲食量明顯減少、反應遲鈍、蜷縮拱背、精神萎靡等情緒和行為的改變，與對照組和尿毒癥組形成明顯的反差。

2.2 抓力影響 實驗前8周，3組間抓力差異無統計學意義（≤1.912，＞0.05），從第8周開始，造模組抓力出現逐漸下降的趨勢，第16周時造模組抓力小于對照組（=4.42＜0.05）；尿毒癥組亦較對照組有所減少，但差異無統計學意義（＞0.05）。見圖2。

圖2 造模期間各組大鼠大鼠抓力變化情況

2.3 大鼠體質量、腓腸肌重量及SI比值變化 對照組大鼠體質量逐漸增加；尿毒癥組造模前4周體質量下降，6周后體質量趨于穩定；造模組大鼠體質量從第10周開始出現明顯減少，至第16周時體質量顯著減少（=7.5363＜0.05），見圖3。第16周時，造模組大鼠腓腸肌重量低于其他兩組（=3.675＜0.05）；見圖4。第16周時，造模組SI值較對照組顯著下降（=6.32＜0.05），且下降幅度大于2倍SD，提示造模組大鼠肌肉減少癥模型成功；尿毒癥組SI值較對照組有所下降，但差異無統計學意義（＞0.05），造模組SI值與尿毒癥組差異有統計學意義（=3.95＜0.05），見圖5。

圖3 各組大鼠體質量變化情況

圖4 16周末各組大鼠腓腸肌重量情況

圖5 16周末各組大鼠SI比值情況

2.4 大鼠腓腸肌細胞橫截面積變化第16周時，造模組腓腸肌細胞橫截面積低于尿毒癥組和對照組（=23.35，＜0.05），尿毒癥組與對照組比較有所減少，但差異不明顯。肌細胞橫斷面積的變化與腓腸肌重量的改變相一致，見圖6。

圖6 16周末各組大鼠腓腸肌細胞橫截面積情況

3 討論

肌少癥在尿毒癥血液透析患者中發病率逐漸增高，目前普遍認為與酸中毒、微炎癥狀態、蛋白質-能量消耗等因素密切相關，是多種風險因素與相關發病機制相互作用的結果[7-9]。臨床發現尿毒癥患者肌少癥患病率極高，考慮除了尿毒癥疾病相關外，還與患病后運動缺乏，食欲下降，以及存在焦慮抑郁心理相關。長期的運動缺乏、攝食減少及心理應激狀態下肌肉組織結構功能均會發生改變，表現為肌力的減少及萎縮樣變化[10-11]。本研究結合尿毒癥的臨床特點，將尿毒癥大鼠放置于束縛制動筒內，限制其自由活動及飲食，使其正常生存本能受阻而不能表達，從肌少癥病因學的多角度進行干預，使之更加接近肌少癥的特性。結果發現，與其他組相比，造模組大鼠體質量在第16周時顯著減少；同時，大鼠腓腸肌重量也顯著下降；SI值較對照組顯著下降，且下降幅度大于2倍SD，提示采用5/6腎切除+慢性限制性活動在第16周即可造模成功。與其他組相比，造模組大鼠從第8周開始出現抓力下降，在第16周時，抓力顯著減少（＜0.05）；而大鼠體質量從第10周才開始出現減少，至第16周時除體質量明顯下降外，大鼠腓腸肌大小、重量及肌細胞橫截面積均也顯著下降（＜0.05），這提示大鼠肌肉功能變化先于其形態變化。肌少癥發生除了常見尿毒癥致病因素外，運動、攝食減少及慢性心理應激也在其發生發展中也起著重要作用。本動物模型采用在尿毒癥基礎上聯合慢性限制性應急在第16周時即可成功制造肌少癥動物模型，該模型除了可以了解尿毒癥肌肉萎縮改變外，也可以在去除慢性限制性應急后建立尿毒癥肌少癥逆轉模型。與傳統的造模方法相比，如衰老引發的肌少癥需要20～24個月才能實現[12]。而下肢懸吊法以懸吊側肢體萎縮為主，對懸吊側肢體損傷較大，動物死亡率高，在去除懸吊解除后很難逆轉肌少癥?；蚯贸齽游锬Ｐ?，雖能夠反映衰老的特征，然而炎癥參與肌肉減少的支持缺乏依據[13]。與傳統方法相比，本造模方法具有死亡率低，成模周期短，簡單方便易操作，肌少癥逆轉模型容易實現等優點。

綜上所述，采用尿毒癥大鼠聯合慢性限制性活動能較好地模擬肌少癥過程，動物死亡率低，造模周期短，過程方法簡單方便、易實現，為今后研究肌少癥的發病機制及防治方法提供基礎。