數據挖掘分析polo樣激酶家族在乳腺癌mRNA中的表達與預后的關系

仇騫慧，仇伊爾，陸國文，鄔穎杰

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，損害婦女的身體健康和心理健康，且近年來其發病呈年輕化趨勢[1]。盡管腫瘤的診治技術水平發展迅速，但乳腺癌，特別是三陰性乳腺癌的治療仍是一個難題。目前備受醫患關注的靶向治療具有選擇性高、對正常組織無損害等優點，已成為眾多腫瘤治療方式中的首選，但靶向治療的發展需要進一步探究腫瘤分子機制。

Polo樣激酶家族（PLKs）包括PLK1、PLK2、PLK3、PLK4及PLK5，它們在正常細胞和癌細胞的DNA復制和有絲分裂中都起著重要的作用[2-3]。PLK1是該家族中被研究最深入的成員，在許多癌癥中出現異常表達，包括乳腺癌、鼻咽癌、膠質母細胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、白血病、黑色素瘤、生殖系統腫瘤和消化道腫瘤等[4]。研究表明，PLK1過表達可能加速了TP53（一種腫瘤抑制因子）的破壞而導致癌細胞增殖和轉移。在人類癌癥患者中，50%以上TP53被破壞[3]。PLK2（也稱為SNK）可能是一種腫瘤抑制因子，據報道，PLK2在血液系統惡性腫瘤中的表達顯著降低[5]。PLK3在GO和細胞周期晚期表達[6]，有PLK3缺陷的小鼠被發現多個器官自發地形成了腫瘤[7]。PLK4是著絲粒調控蛋白，可增加非整倍體的風險，抑制PLK4的表達可提高癌癥治療敏感性[8]。目前對于PLK5的研究很少，有研究指出，PLK5在人腦腫瘤中表達下調[9]。本研究通過數據挖掘分析不同Polo樣激酶家族（PLKs）在人乳腺癌mRNA中的表達水平及與預后的關系，現報道如下。

1 臨床資料

1.1 數據庫檢索

1.1.1 Oncomine數據庫 使用該數據庫在對應欄中輸入基因名稱、腫瘤類型、mRNA水平和樣本類型值0.01（可更改），表達差異（fold change，可自定），基因排名（Ranking 10%，可自定）等，研究PLKs在不同腫瘤中的差異表達，制成差異全景圖。

1.1.2 GEPIA2數據庫 在數據庫的對應框中輸入研究基因名稱，選擇要分析的腫瘤（如BRCA）。本研究利用該數據庫分析了乳腺癌組織和正常乳腺組織中PLKs的表達情況。

1.1.3 UALCAN數據庫 在UALCAN數據庫輸入研究的基因，再在TCGA數據庫樣本中選擇研究腫瘤來分析有關預后的各種因素。本研究利用UALCAN數據庫分析了不同PLKs的表達水平與癌癥分期、分類和個體年齡之間的關系。

1.1.4 Kaplan-Meier plotter繪圖儀 通過繪圖儀分析了乳腺癌患者的無復發生存期（RFS）、總生存期（OS）、無遠處轉移生存期（DMFS）和治療后進展率（PPS）。

1.1.5 cBioPortal數據庫 采用cBioPortal（www.cbioportal.org） 數 據 庫（選 擇TCGA庫，包括了1907例病理診斷為乳腺癌的患者）基因欄分別輸入PLKs來探索其基因變化，包括突變、擴增、深度缺失和多重mRNA的變化。

1.1.6 LinkedOmics數據庫 采用Linked Omic（shttps://www.linkedomics.orglogin.php）數據庫分析基因（如PLK1、PLK2）表達水平之間的關系。

1.1.7 功能富集和生物信息學分析 在該數據庫輸入研究基因，物種選擇智人。出現的富集分析結果包括細胞亞定位（CC）、生物過程（BP）和分子功能（MF），pathway內可見相關信號通路。

1.2 結果

1.2.1 PLKs在各腫瘤中的差異表達使用Oncomine數據庫得到了一張差異全景圖，比較乳腺癌樣本和對照樣本中PLKs mRNA的差異表達。其中有11個數據集顯示，乳腺癌患者中PLK1mRNA的表達水平上調，6組數據顯示PLK4高表達。見封二彩圖3。

1.2.2 PLKs表達與乳腺癌患者臨床病理特征的關系 乳腺癌樣本中PLK1、PLK4的水平高于正常樣本，見封二彩圖4。應用UALCAN數據庫分析了PLKs的mRNA表達水平與乳腺癌腫瘤分期關系、與乳腺癌患者生理年齡段的關系、與乳腺癌種類分型關系、與乳腺癌淋巴轉移分期的關系以及其與TP53突變的關系，見封二彩圖5～6、封三彩圖1～3。在UALCAN數據庫中，目前還沒有PLK5與乳腺癌臨床病理參數關系的研究數據。PLK1、PLK4在乳腺癌整個腫瘤分期、乳腺癌患者全年齡、所有臨床類型乳腺癌、乳腺癌各級淋巴結轉移和TP53突變中均高表達，而PLK2、PLK3呈低表達或無統計學意義。

1.2.3 PLKs表達與乳腺癌患者預后的關系PLK1、PLK4高表達降低了RFS、OS及DMFS。同時PLK1、PLK3和PLK4的高表達降低了PPS。而PLK3和PLK5高表達增加了RFS，PLK2和PLK5高表達增加了DMFS。見表1。

表1 PLKs表達與乳腺癌患者RFS、DMFS、OS和PPS的關系

1.2.4 乳腺癌患者中的PLKs基因突變情況28例（1.52%）乳腺癌樣本中的PLKs發生了改變。突變、擴增、深度缺失和多重mRNA變化的頻率分別為1%、0.21%、0.26%和0.05%。根據乳腺癌病理分型和細分結果展示，乳腺浸潤性導管癌1473例，PLKs突變22例（1.49%），其中突變、擴增、深度缺失和多次mRNA變化的發生率分別為0.95%、0.27%、0.2%和0.07%。229例乳腺浸潤性小葉癌中，5例（1.67%）PLKs異常突變，出現了突變和深度缺失，發生率分別為1.34%和0.33%。在89例乳腺導管和小葉混合癌中，只有1例（1.12%）發生PLKs突變。見圖1。

圖1 乳腺癌PLKs基因突變情況

1.2.5 乳腺癌中PLKs之間的關系PLK1與PLK2（=－0.2999，＜0.05）、PLK3（=－0.1596＜0.05）和PLK5（=－0.1798＜0.05）呈負相關，而PLK1與PLK4（=0.7264＜0.05）呈正相關。PLK2與PLK3（=0.0950＜0.05）呈正相關，與PLK4（=－0.1933，＜0.05）呈負相關。PLK3與PLK4呈負相關（=－0.2683，＜0.05），PLK3與PLK5呈正相關（=0.1599，＜0.05）。PLK4與PLK5呈負相關（=－0.2086＜0.05）。PLK2與PLK5之間無顯著相關性。

1.2.6 乳腺癌中PLKs富集情況的分析為了進一步研究PLKs在乳腺癌中的作用，我們基于David數據庫對PLKs進行了功能富集分析。如圖2所示，有19個GO項目被富集。PLKs富集在以下生物過程（BP）：蛋白質磷酸化，有絲分裂細胞周期G2/M過渡過程負調控，G2DNA凋亡損傷檢查點，有絲分裂細胞周期檢查點，DNA損傷反應、信號轉導p53介質導致細胞周期阻滯，蛋白酶體依賴泛素蛋白分解代謝過程調節，有絲分裂細胞周期G1/S過渡，肽基礎絲氨酸、磷酸化，有絲分裂及凋亡過程的負調控。細胞亞定位（CC）：PLKs與中心體、核仁、染色質、突觸、中心粒和細胞質相關。分子功能（MF）：PLKs與蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、ATP結合和蛋白激酶活性相關。只有一個KEGG通路在PLKs中富集，即FoxO家族信號通路。

圖2 PLKs的GO富集分析（David）

2 討論

PLK1可能在腫瘤的侵襲生長和淋巴及遠處轉移中發揮作用。研究發現，PLK1的陽性表達率在乳腺癌組織中明顯高于癌旁組織，表明PLK1過表達可能導致非整倍體的出現，使染色體不穩定。此外，PLK1與乳腺癌的淋巴結轉移、pTNM分期相關，提示PLK1與乳腺癌組織的侵襲生長、轉移相關，可能是乳腺癌患者預后的重要指標[10]。Maire等[11]發現，與LA、LB和HER-2的乳腺癌類型相比，PLK1在三陰性乳腺癌（TNBC）中的表達水平更高。據報道，PLK1在多種人類癌癥中高表達，抑制PLK1可降低癌細胞的存活率，誘導細胞凋亡，增加細胞化學藥物的敏感性，且對正常細胞影響不大[4]。由于TNBC沒有特異性的治療靶點，而PLK1在TNBC中高表達，因此使用PLK1抑制劑治療TNBC可能是一種可行的方法。TNBC比其他亞型乳腺癌更具侵襲性，長期復發率更高，預后更差，同時缺乏ER、PR和HER-2的表達。因此，針對其他亞型乳腺癌的有效靶向藥物對TNBC的治療效果較差。目前，TNBC的治療仍以傳統化療為主，但TNBC患者要承受化療的巨大毒副作用，可體內的腫瘤卻對化療藥物不敏感，因此，PLK1及其抑制劑在TNBC治療中的研究仍值得進一步探索。

PLK2具有許多細胞外周期效應，如促進細胞分化、抑制腫瘤形成及參與突觸激活后的重構等。PLK2在腫瘤細胞的增殖和存活中有著重要作用，可能是癌癥治療的潛在靶點[12]。本研究結果顯示PLK2的表達與PLK1的表達呈負相關。PLK2高表達可提高乳腺癌患者的DMFS，猜測PLK2可能在乳腺癌的發生和病情發展過程中起著負調控作用。

PLK3可以抑制ER陽性乳腺癌的細胞增殖。Naik等[13]研究發現，抑制乳腺癌細胞中的PLK3活性可導致乳腺癌細胞的異常增殖。因此，推測PLK3和雌激素敏感性指狀蛋白（Efp）可能參與了ER陽性的乳腺癌患者內分泌治療出現耐藥的過程。在ER陽性乳腺癌中，雌激素可促進Efp的高表達，從而加速PLK3的降解，這對于雌激素依賴的ER陽性乳腺癌細胞的增殖是更有利的。故PLK3表達的變化可能影響著內分泌耐藥的形成。

PLK4，也被稱為SAK或STK18，在異種移植瘤動物模型中，藥物抑制PLK4的表達或降低其活性可抑制腫瘤細胞增殖，促進細胞凋亡，抑制腫瘤生長[14]。本研究結果顯示，乳腺癌患者中PLK4高表達降低了OS、DMFS、PPS和RFS。在相關性研究中，PLK4與PLK1兩者表達呈正相關，進一步說明PLK4具有致癌作用。

PLK5與PLK2、PLK3有很大的同源性[9]。PLK5蛋白主要位于細胞核，PLK5表達可抑制G1期進入S期，誘導氧化應激和DNA損傷反應，在細胞中的作用主要表現為增殖細胞的下調和靜止細胞的積累[9，15]。本研究，PLK5的高表達提高了患者的RFS和DMFS。

本研究系統分析PLKs在乳腺癌患者中的mRNA表達水平、突變程度及預后價值后，結果顯示PLK1和PLK4過表達與乳腺癌患者生存預后不良相關，且PLK1在乳腺癌中的表達與PLK4的表達呈正相關。乳腺癌中PLK2與PLK3表達正相關，乳腺癌中PLK3與PLK5表達正相關，PLK2與PLK5不相關。PLK2、PLK3和PLK5過表達提示預后良好。