藥用與食用黃精次生代謝產物差異分析及改善胰島素抵抗的活性成分與作用機制研究

陳 林，王 敏，胡 媛，劉友平，陳鴻平，王 福

成都中醫藥大學藥學院 西南特色中藥資源國家重點實驗室，成都 611137

胰島素抵抗(insulin resistance，IR)一般是指正常濃度下胰島素靶細胞對定量濃度的胰島素生物學應答敏感性降低，即胰島素促進葡萄糖攝取和利用作用受損，導致胰島素分泌代償性增多，引起骨骼肌、肝臟、脂肪等組織對胰島素敏感性下降和對葡萄糖的利用障礙[1]。其中，IR是2型糖尿病重要的發病機制之一，貫穿于2型糖尿病全過程[2]。目前，治療IR的藥物主要為胰島素增敏劑，但存在骨折、水腫、肝損傷等副作用[3]。

黃精PolygonatumsibiricumRed.為百合科黃精屬植物，為《中國藥典》2020年版收載的3種黃精之一，以干燥塊莖入藥，為常見藥食兩用品，因其外形呈結節狀彎柱形類似雞頭，俗稱雞頭黃精，廣泛分布于四川、湖南、江西等地區，性味甘平、無毒，具有補氣養陰，健脾，潤肺，益腎的功效，用于治療脾胃氣虛，體倦乏力，內熱消渴等證[4]，主要含有多糖、皂苷、黃酮、生物堿及蒽醌等成分[5]。臨床上，黃精復方被廣泛用于2型糖尿病的治療，對氣陰兩虛型2型糖尿病可以緩解患者的中醫證候，降低血糖、血脂，改善胰島功能[6]。文獻報道黃精復方改善胰島功能的機制認為，其活性成分通過作用于PI3K和STAT3等靶點，進一步影響蛋白質絲氨酸/蘇氨酸活動、PI3K-AKT等信號通路而發揮作用[7]；黃精單味藥改善胰島功能的機制研究認為，黃酮類化合物通過作用于突觸后膜，改變細胞對藥物的敏感性、細胞神經遞質受體活性等生物過程及調控鈣離子、激素抵抗等信號通路起到了改善IR的作用[8]。

目前，HPLC、LC-MS/MS、UPLC-Q-TOF-MS等技術常用于黃精化學成分的定性與定量研究，已報道黃精含有黃酮類成分以及生物堿等化學成分[9]，但普遍存在檢測成分數量少，難以反映黃精中所含全部代謝產物。近年來，隨著代謝組學技術的發展，基于UPLC-ESI-MS/MS的廣泛靶向代謝組學技術廣泛用于中藥代謝產物的研究，與傳統常見色譜技術相比具有高靈敏度、低成本、高通量的優勢[10,11]。由于目前尚未見藥用與食用黃精整體次生代謝產物差異分析報道，本文以藥用黃精(PolygonatumsibiricumRed.)以及食用黃精(互葉卷黃精PolygonatumalternicirrhosumHand.-Mzt.，俗稱水果黃精)為研究對象，首次采用UHPLC-ESI-MS/MS廣泛靶向代謝組學技術對其次生代謝產物進行全面檢測，并采用主成分分析(PCA)、HCA聚類分析以及正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)對代謝產物進行比較分析，篩選差異代謝物；其次對藥用黃精與食用黃精差異代謝物相對含量變化前十且上調的化合物進行改善胰島素抵抗的網絡藥理分析，并對活性成分和關鍵靶點進行分子對接，選用HepG2細胞進行細胞實驗驗證。一方面以期全面了解藥用與食用黃精差異代謝物，為黃精品質評價奠定基礎，另一方面擬篩選治療IR的潛在活性成分，為闡述黃精治療IR的作用機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

超高效液相色譜-質譜聯用儀(ultra-high performance liquid chromatography，UHPLC，Shim-pack UFLC SHIMADZU CBM30A，Tandem mass spectrometry，MS/MS，Applied Biosystems 6500 QTRAP)；色譜柱(Waters T3 C181.8 μm，2.1 mm×100 mm)；FA2003電子分析天平(上海浦春)；MM400球磨儀(德國萊馳)；TGL-16臺式高速離心機、2500-A臺式低速離心機(湖南湘儀實驗儀器有限公司)；凍干機(Scientz-100F)；移液槍(德國Eppendorf公司)；HCB-1300V潔凈工作臺、HCP-168二氧化碳培養箱(青島海爾生物醫療股份有限公司)；B25-12D超聲波清洗儀(寧波新藝超聲波設備有限公司)；UPT-12D優普系列超純水機(成都超純科技有限公司)；GR85DA高壓滅菌鍋(美國ZEALWAY INSTRUMENT INC)；NIKON DS-U3成像系統(日本尼康)；Allegra X-12R冷凍離心機(Beckman Coulter)；CKX53顯微鏡(奧林巴斯有限公司)；3001酶標儀(Thermo Fisher Scientific Oy)；HB120-S金屬浴、D1008掌上離心機、MX-S可調式混勻儀(大龍興創實驗儀器有限公司)；EPS-300數顯式穩壓穩流電泳儀、VE-180B垂直電泳槽、VE586轉移電泳槽(上海天能科技有限公司)；TS-2脫色搖床(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)。

乙腈(美國Fisher chemical，色譜純)；娃哈哈純凈水；甲酸(美國，MREDA Technology Inc)；甲醇、乙醇(北京化工廠，分析純)；二甲亞砜(成都市科隆化學品有限公司，分析純)；二甲基亞砜(Sigma，細胞級，批號SHBK2703)；胰酶細胞消化液(Biosharp，批號70090500)；胎牛血清、PBS緩沖液(BI，批號分別為2106044、2138268)；青霉素-鏈霉素雙抗溶液(美國HyClone公司，批號J190033)；DMEM培養基(Gibco，批號8121557)；DMEM高糖培養基、脫脂奶粉(北京索萊寶科技有限公司，批號分別為20211124、107B055)；BCA蛋白定量試劑盒、化學發光檢測試劑盒、PAGE凝膠快速制備試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、TBST、快速轉膜緩沖液、電泳緩沖液、RIPA裂解液、BSA蛋白標準、三色預染Marker、PVDF膜(上海雅酶生物科技有限公司，批號分別為01543050、024B1100、024A1250、01461050、034B1200、01451040、034B1200、014B1070、01542050、02552410、280659340)；噻唑藍(安耐吉生物，批號EQ9RED6D)；葡萄糖測定試劑盒(上海榮盛生物藥業有限公司，批號為20211208137)；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠、兔抗AKT1、兔抗mTOR、兔抗VEGF(碧云天生物技術研究所，批號分別為A0208、A0216、AF1777、AF1648、AF0312)；β-actin、鼠抗AMPK、鼠抗PI3K(景杰生物，批號分別為RL080946、ML081163、L011304)；異鼠李素、野漆樹苷(上海同田生物技術有限公司，批號分別為21041623、21080923)；異野漆樹苷(西力生物，批號為BBP01924)；精蛋白人胰島素混合注射液(通化東寶藥業股份有限公司，國藥準字S20030004)；鹽酸二甲雙胍緩釋片(山東司邦得制藥有限公司，國藥準字H20060230)。

實驗所用細胞為人肝癌細胞系HepG2細胞，來自于成都中醫藥大學藥學院；實驗所用樣品采集于重慶市秀山土家苗族自治縣八家路村，收集時間為2020年7月9日，經成都中醫藥大學嚴鑄云教授鑒定，樣品1為互葉卷黃精(PolygonatumalternicirrhosumHand.-Mzt.)新鮮全株；樣品2為藥用黃精(PolygonatumsibiricumRed.)新鮮全株。1號樣品為地方野生食用品種，該品種因多糖含量高，口感甜，俗稱水果黃精(SGHJ)；2號樣品為藥典收載藥用品種(HJ)。樣品1與2各收集3批次，編號標記，返回實驗室后，將樣品塊莖放置于凍干機中真空冷凍干燥，采用研磨儀研磨(30 Hz，1.5 min)至粉末狀，保存于-80 ℃冰箱，備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備

取藥用與食用黃精干燥樣品(過四號篩)100 mg，量取1.0 mL甲醇水溶液(70%甲醇)溶解，超聲0.5 h，低溫靜置12 h，期間渦旋3次，離心并吸取上清，過濾，于進樣瓶中備用。

1.2.2 色譜與質譜條件

質譜與色譜條件參考文獻報道方法[12]。液相條件主要包括：(1)色譜柱：Agilent SB-C181.8 μm，2.1 mm×100 mm；(2)流動相：A相為超純水(加入0.1%的甲酸)，B相為乙腈(加入0.1%的甲酸)；(3)洗脫梯度：0.00 min B相比例為5%，9.00 min內B相比例線性增加到95%，并在95%維持1 min，10.00～11.10 min，B相比例降為5%，并以5%平衡至14 min；(4)流速0.35 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量4 μL。質譜條件主要包括：LIT和三重四極桿(QQQ)掃描是在三重四極桿線性離子阱質譜儀(Q TRAP)，AB4500 Q TRAP UPLC/MS/MS系統上獲得的，該系統配備了ESI Turbo離子噴霧接口，可由Analyst 1.6.3軟件(AB Sciex)控制運行正負兩種離子模式。ESI源操作參數如下：離子源，渦輪噴霧；源溫度550 ℃；離子噴霧電壓(IS)5 500 V(正離子模式)/-4 500 V(負離子模式)；離子源氣體I(GSI)、氣體II(GSII)和簾氣(CUR)分別設置為50、60和25.0 psi，碰撞誘導電離參數設置為高。在QQQ和LIT模式下分別用10和100 μmol/L聚丙二醇溶液進行儀器調諧和質量校準。QQQ掃描使用MRM模式，并將碰撞氣體(氮氣)設置為中等。通過進一步的DP和CE優化，完成了各個MRM離子對的DP和CE。根據每個時期內洗脫的代謝物，在每個時期監測一組特定的MRM離子對。

1.2.3 代謝物定性定量原理

代謝物結構解析參考了MassBank(http://www.massbank.jp)、KNAPSAcK(http://kanaya.naist.jp/KNApSAcK)、HMDB(http://www.hmdb.ca)、MoToDB(http://www.ab.wur.nl/moto)、METLIN(http://metlin.scripps.edu/index.php)、MWDB(metware database)等已有的質譜數據庫。代謝物定量是利用三重四級桿質譜的多反應監測模式(multiple reaction monitoring，MRM)分析完成。MRM模式中，四級桿首先篩選目標物質的前體離子(母離子)，排除掉其他分子量物質對應的離子以初步排除干擾；前體離子經碰撞室誘導電離后斷裂形成很多碎片離子，碎片離子再通過三重四級桿過濾選擇出所需要的一個特征碎片離子，排除非目標離子干擾，使定量更為精確，重復性更好。

根據新村金礦床原生暈及各項地球化學參數的研究，繪制礦床成礦元素空間分布示意圖(圖5)。從示意圖中可以看出，成礦熱液由礦區北北西側深部沿構造通道多次分期上侵至礦區。根據礦床原生暈的大致分帶情況可知，礦區的原生暈軸向分帶為以Mo-Ni-Co-Cu為后尾暈，以W-Au-Ag-As-Sb為中心暈，以Mn-Ba-Zn-Pb-Hg為前緣暈。而示意圖中實線所標示的原生暈中心正是新村金礦主要礦體部分，故可以推斷在-60中段的下方，仍舊有大部分金礦體的存在，同時也表明礦區北北西側深部仍有較大找礦空間。

1.2.4 代謝物定性定量分析

圖1A所示為混合樣品的總離子流圖(TIC)，縱坐標為離子流強度，橫坐標為保留時間。基于“1.2.3”所列代謝數據庫，對本實驗所有樣本的代謝物進行了質譜定性定量分析。為了比較所檢測到代謝物的含量差異，對檢測到的每個代謝物的質譜峰進行校正。獲得不同樣本的代謝物質譜分析數據后，對所有物質質譜峰進行峰面積積分，并對其中同一代謝物在不同樣本中的質譜出峰進行積分校正。

圖1 QC樣本質譜檢測TIC重疊圖(A)與混合樣品TIC圖(B)Fig.1 TIC overlapping map of QC sample (A) and TIC map of mixed sample (B)

1.2.5 樣本質控分析

在實驗過程中，為確保實驗的準確性，在每2個檢測分析樣本中插入一個質控樣本，以監測分析過程中的重復性。通過對不同質控樣本質譜檢測分析的總離子流圖(見圖1B)進行重疊展示分析，可以判斷代謝物提取和檢測的重復性，即技術重復。儀器的高穩定性為數據的重復性和可靠性提供了保障。

1.2.6 網絡藥理分析

1.2.6.1 藥物成分及靶點篩選

使用PubChem數據庫獲得藥用黃精與食用黃精差異代謝物相對含量變化前10且上調的化合物的結構，導入Swiss Target Prediction數據庫，取預測得分大于0的靶標作為藥物靶點。

1.2.6.2 IR疾病靶點蛋白的確認

以“insulin resistance”為檢索詞檢索DisGeNET、CTD、GeneCards與OMIM數據庫獲取IR的疾病靶點蛋白，去除重復值后運用UniProt數據庫對其進行蛋白名稱標準化，以備進一步分析。運用R 3.6.0將黃精的藥物靶點與IR的疾病靶點取交集，作為黃精治療IR的潛在作用靶點。

1.2.6.3 藥物-成分-靶點-疾病網絡構建

使用Cytoscape 3.7.2軟件，構建“藥物-成分-靶點-疾病”網絡圖，使用Network Analyzer功能對黃精的主要活性成分進行分析，將黃精潛在活性成分與藥物-疾病共同靶點輸入Cytoscape軟件中，繪制出“藥物-成分-靶點-疾病”相互作用的網絡圖。

1.2.6.4 PPI網絡構建

將上述藥物-疾病共同靶點輸入到STRING數據庫中進行檢索，設置蛋白種類為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值為0.4，構建蛋白相互作用的PPI網絡。

1.2.6.5 分子對接驗證

運用AutoDock Vina軟件(1.2.2)和Pymol軟件對“1.2.6.1”和“1.2.6.2”篩選活性成分與關鍵靶點進行對子對接，評價黃精活性成分與關鍵靶點之間的結合活性，并以結合能來評價其結合活性。

1.2.7 細胞實驗驗證

1.2.7.1 HepG2細胞培養

HepG2細胞復蘇后，用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素混合液的DMEM完全培養基于37 ℃、5% CO2培養箱培養，待細胞貼壁且匯合度達80%以上，用0.25%胰酶消化傳代，取對數生長期的細胞用于實驗。

1.2.7.2 MTT法檢測野漆樹苷、異野漆樹苷、異鼠李素對HepG2細胞存活率的影響

將對數生長期的HepG2細胞以4 000個/孔的密度接種于2塊96孔板中，每孔100 μL，培養箱培養24 h，吸棄培養基。設置空白組、對照組和藥物處理組。空白組僅加入不含藥DMEM完全培養基，不接種細胞，對照組加入不含藥DMEM完全培養基，藥物處理組加入用不含血清的DMEM培養基配制的不同濃度的野漆樹苷(濃度處理分別為：30、15、7.5、3.8、1.9、1 μg/mL)、不同濃度的異野漆樹苷(濃度處理分別為100、50、25、12.5、6.3、3.2、1.6 μg/mL)、不同濃度的異鼠李素(濃度處理分別為200、100、50、25、12.5、6.3 μg/mL)，每組濃度設3個復孔，培養箱培養24 h后每孔加入20 μL MTT液(5 mg/mL)，培養4 h后吸棄培養基，每孔加入150 μL DMSO，搖床震蕩10 min，于570 nm處測每孔吸光度值并計算細胞存活率，公式如下：

細胞存活率=(藥物處理組OD值-空白組OD值)/

(對照組OD值-空白組OD值)×100%

1.2.7.3 建立HepG2細胞胰島素抵抗(IR)模型與藥物干預處理

取對數生長期的HepG2細胞，以懸液濃度為8×105個/皿的密度接種于直徑為100 mm的細胞培養皿中，培養箱培養至細胞貼壁且匯合度達80%，吸棄培養基，PBS清洗2次，加入無血清培養基饑餓培養12 h，將饑餓培養后的細胞隨機分組為對照組、模型組、陽性對照組、野漆樹苷組、異野漆樹苷組、異鼠李素組，饑餓培養后吸棄培養基，PBS清洗2次，對照組加入DMEM完全培養基，其他組加入新配制的含有胰島素(胰島素濃度為：1×10-6mol/L)的DMEM高糖完全培養基，于培養箱中繼續培養24 h即得胰島素抵抗(IR)模型。24 h后，對照組加入DMEM完全培養基，模型組加入含有胰島素的培養基，陽性對照組加入含有二甲雙胍和胰島素的培養基，根據MTT實驗結果，野漆樹苷組加入含有胰島素和野漆樹苷的培養基，異野漆樹苷組加入含有胰島素和異野漆樹苷的培養基，異鼠李素組加入含有胰島素和異鼠李素的培養基，于培養箱中培養24 h。24 h后取培養基上清，離心，按照葡萄糖檢測試劑盒說明書操作，計算細胞葡萄糖消耗量。

1.2.7.4 Western blot檢測PI3K、AKT1、VEGF、mTOR、AMPK信號通路相關蛋白表達情況

將藥物干預后的細胞棄去培養基，用預冷的PBS清洗2次，加入新配制的RIPA裂解液并收集細胞于預冷的1.5 mL離心管中，用槍頭反復吹打細胞裂解液數次，冰上裂解30 min，于4 ℃、13 000 r/min離心30 min，取上清，用BCA法測蛋白濃度，蛋白加入5×loading buffer于98 ℃煮8 min，使蛋白變性，煮完后冰上預冷，渦旋，離心，放-20 ℃保存備用。制備蛋白上樣樣品，取蛋白樣品10 μg進行SDS-PAGE電泳，濕法轉膜，轉膜后加入適量含5%脫脂奶粉的TBST封閉液于搖床上室溫封閉2 h，封閉完成后，用TBST洗膜，共3次，每次10 min，洗膜完成后加入一抗，4 ℃孵育過夜。次日回收一抗，用TBST洗膜，共3次，每次10 min，加入二抗，于搖床上室溫孵育1 h，用TBST洗膜，共3次，每次10 min，洗膜后ECL法顯影。采用Image J軟件對目的條帶進行灰度值分析：目的蛋白表達量=目的蛋白灰度值/β-actin灰度值。

1.2.7.5 數據分析

2 實驗結果

2.1 樣品中次生代謝產物的鑒定

經過分析本文共鑒定出319種次生代謝產物，包括酚酸類86種，黃酮類96種，蒽醌類5種，木脂素與香豆素25種，鞣質3種，生物堿51種，萜類11種，甾體21種，其他類21種。代謝物含量數據采用極差法進行歸一化處理，通過R軟件(www.r-project.org/)，對代謝物在不同樣本間的積累模式進行聚類分析(hierarchical cluster analysis，HCA)。通過聚類分析(見圖2A)可知，同一品種不同批次的藥用黃精和食用黃精存在次生代謝物差異，種內次生代謝物變異較大；不同批次藥用黃精與食用黃精次生代謝物分別聚為一類，可以明顯區分。從熱圖可以判斷，藥用黃精與食用黃精次生代謝產物差異較大，藥用黃精次生代謝物相對含量普遍高于食用黃精，且相對含量較高的次生代謝物數量占優。

圖2 藥用黃精與食用黃精代謝物的聚類(A)與主成分(B)分析Fig.2 HCA (A) and PCA (B) analyses of medicinal and edible Polygonati Rhizoma

2.2 主成分分析(PCA)與正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)

本文通過主成分分析方法將次生代謝物的差異通過降維處理以直觀反映樣本之間的代謝物差異情況。圖2B中可以看出，主成分PC1與PC2的占比分別達到了48.01%和20.36%，積累貢獻率達到了68.37%。藥用黃精與食用黃精分別聚為一類，可明顯區分，實驗結果與聚類分析一致；正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)被廣泛用于代謝組數據的分析，由于其分析方法可以最大化組間差異常被用于差異代謝物的篩選。在OPLS-DA分析中，Q2是一個重要的參數，若數值大于0.9，則可以反映該模型的可靠性與穩定性。圖3A中可以看出，藥用黃精與食用黃精比較組OPLS-DA模型中Q2為0.996，其數值大于0.90，證實該模型可以用以下一步的差異代謝物分析。

圖3 藥用黃精與食用黃精代謝物的OPLS-DA(A)與差異代謝物分析(B)圖Fig.3 OPLS-DA (A) and volcanic plots (B) of differential metabolites of medicinal and edible Polygonati Rhizoma

2.3 差異代謝物的篩選、注釋與富集

本文結合單變量分析的差異倍數值(fold change)與多變量分析OPLS-DA模型中變量重要性投影(variable importance in project，VIP)數值進行樣品之間的差異代謝物篩選。篩選標準為選取fold change≥2或fold change≤0.5和VIP≥1的差異代謝物，即代謝物在組間差異為2倍以上或0.5倍以下以及VIP≥1，則認為差異顯著。結果表明，藥用黃精與食用黃精共計篩選出106種差異代謝物，從圖3B中可以看出，上調化合物85種，下調化合物21種。藥用黃精與食用黃精樣品之間差異代謝物經過數據庫KEGG注釋，其分類結果顯示(見圖4A)，差異代謝物主要參與次級代謝生物合成、黃酮類生物合成、黃酮與黃酮醇生物合成、異黃酮生物合成與生物堿生物合成；KEGG富集結果顯示(見圖4B)，差異代謝物富集主要集中于黃酮、異黃酮與黃酮醇代謝途徑。為進一步了解藥用黃精與食用黃精次生代謝物含量差異變化較大物質，篩選了差異代謝物相對含量變化前十的化合物(見表1)。藥用黃精與食用黃精比較相對含量上調的9種，分別為：異鼠李素、薯蕷皂苷元-3-O-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-(6′′-對香豆酰)葡萄糖苷、異野漆樹苷、野漆樹苷、苜蓿素-4′-O-葡萄糖苷-7-O-葡萄糖苷、纖細薯蕷皂苷、薯蕷皂苷元-3-O-β-D-葡萄糖基(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-[-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)]-β-D-葡萄糖苷、延齡草苷-6′-O-槐三糖苷；相對含量下調的化合物1種：27-O-(3-羥基-3-甲基戊二酰)螺柱-5-烯-3β,27-二醇(異炔醇酮)-3-O-鼠李糖-(1→2)-O-[葡萄糖-(1→4)]-葡萄糖苷。

圖4 藥用黃精與食用黃精差異代謝物KEGG分類圖(A)與富集圖(B)Fig.4 KEGG classification (A) and KEGG enrichment statistics (B) of medicinal and edible Polygonati Rhizoma

表1 藥用黃精與食用黃精差異代謝物相對含量變化前10的化合物

續表1(Continued Tab.1)

2.4 網絡藥理分析

將藥用黃精與食用黃精差異代謝物相對含量變化前十的化合物作用的靶點與IR的疾病靶點用R 3.6.0取交集后獲取靶點59個，為藥用黃精改善IR的作用靶點，用Venny 2.1做出韋恩圖，如圖5A所示，黃色代表IR的疾病靶點，藍色代表化合物的作用靶點，重合部分為化合物靶點與疾病靶點的交集靶點，其中僅5種化合物與IR疾病靶點相重合。從“藥物-成分-靶點-疾病”相互作用的網絡圖(見圖5B)可以看出，異鼠李素、野漆樹苷、異野漆樹苷3種黃酮類化合物通過PI3K、AKT1、VEGFA、mTOR、AMPK等核心靶點作用于PI3K-Akt、mTOR、VEGF、AMPK等信號通路，同時通路中各靶點蛋白相互作用(見圖5C～5D)。KEGG富集圖(見圖5E)結果表明，PI3K-Akt信號通路、mTOR信號通路等信號通路富集明顯。分子對接結果表明(見圖6)，異鼠李素、野漆樹苷、異野漆樹苷與核心靶點PI3K、AKT1、VEGFA、mTOR、AMPK結合度好，其結合能均≤20.9 kJ/mol。

圖5 黃精與治療疾病的網絡藥理分析Fig.5 Network pharmacological analysis of Polygonati Rhizoma and therapeutic diseases注：(A)黃精與胰島素抵抗靶點韋恩圖；(B)藥物-成分-靶點-疾病相互作用的網絡圖；(C～D)蛋白相互作用網絡；(E)黃精治療胰島素抵抗的KEGG富集分析。Note:(A) Venn diagram of Polygonati Rhizoma and insulin resistance targets;(B) Network diagram of drug-component-target-disease interactions;(C-D) Protein-protein interaction network;(E) KEGG enrichment analysis of Polygonati Rhizoma for insulin resistance.

2.5 野漆樹苷、異野漆樹苷、異鼠李素對HepG2 細胞活性的影響

采用MTT法檢測野漆樹苷、異野漆樹苷、異鼠李素對HepG2細胞活性的影響，結果如圖7所示。與對照組相比，HepG2細胞經不同濃度的藥物處理24 h后，細胞活性發生明顯改變，野漆樹苷藥物處理組中30、7.5 μg/mL濃度處理組的細胞存活率較高，異野漆樹苷藥物處理組中25、3.2、1.6 μg/mL濃度處理組的細胞存活率較高，異鼠李素藥物處理組中100、50 μg/mL濃度處理組的細胞存活率較高?；谒幬飳毎钚缘挠绊?、藥物濃度的有效性以及藥物配制過程中的誤差，本實驗選擇7.5 μg/mL野漆樹苷、3.2 μg/mL異野漆樹苷和100 μg/mL異鼠李素進行下一步的實驗。

2.6 野漆樹苷、異野漆樹苷、異鼠李素對IR HepG2細胞葡萄糖消耗量的影響

野漆樹苷、異野漆樹苷、異鼠李素對IR HepG2細胞葡萄糖消耗量的影響的結果如圖8所示，與對照組比較，經過胰島素處理后，模型組細胞培養基中的葡萄糖含量升高，差異有統計學意義(P<0.01)，說明模型組細胞葡萄糖消耗量降低，模型組細胞產生了IR作用，IR模型建立成功。與模型組比較，野漆樹苷和異野漆樹苷組細胞葡萄糖含量升高，且差異不具有統計學意義，說明野漆樹苷和異野漆樹苷干預后不能改善HepG2細胞IR狀態；與模型組比較，異鼠李素組和陽性對照組細胞葡萄糖含量降低，差異有統計學意義(P<0.05)，表明異鼠李素組細胞葡萄糖消耗量增加，異鼠李素干預后能改善HepG2細胞IR狀態，選擇異鼠李素進行下一步的實驗。

圖6 異鼠李素、野漆樹苷、異野漆樹苷與核心靶點PI3K、AKT1、VEGFA、mTOR、AMPK分子對接結果Fig.6 Docking results of isorhamnetin,rhoifolin and isorhoifolin with core targets PI3K,AKT1,VEGFA,mTOR and AMPK注：A1～A5分別為異鼠李素與靶點PI3K、AKT1、VEGFA、mTOR、AMPK對接圖；B1～B5分別為野漆樹苷與靶點PI3K、AKT1、VEGFA、mTOR、AMPK對接圖；C1～C5分別為異野漆樹苷與靶點PI3K、AKT1、VEGFA、mTOR、AMPK對接圖。Note:A1-A5 are docking diagrams of isorhamnetin with target PI3K,AKT1,VEGFA,mTOR and AMPK respectively;B1-B5 are docking diagrams of rhoifolin and target PI3K,AKT1,VEGFA,mTOR and AMPK respectively;C1-C5 are docking diagrams of isorhoifolin and target PI3K,AKT1,VEGFA,mTOR and AMPK respectively.

圖7 野漆樹苷(A)、異野漆樹苷(B)、異鼠李素(C)對HepG2 細胞活性的影響Fig.7 Effects of rhoifolin (A),isorhoifolin (B) and isorhamnetin (C) on HepG2 cells 注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。Note:Compared with control group,*P < 0.05,**P < 0.01.

圖8 野漆樹苷、異野漆樹苷、異鼠李素對IR HepG2細胞葡萄糖消耗量的影響Fig.8 Effects of rhoifolin,isorhoifolin and isorhamnetin on glucose consumption of IR HepG2 cells 注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。Note:Compared with control group, *P<0.05,**P<0.01;Compared with model group,#P<0.05,##P<0.01.

2.7 異鼠李素對IR HepG2細胞PI3K、AKT1、VEGF、mTOR、AMPK信號通路相關蛋白表達的影響

如圖9所示，本實驗選取β-actin作為內參蛋白，結果顯示內參表達水平趨于一致，表明該實驗具有可靠性。與對照組比較，模型組細胞PI3K、AKT1蛋白表達均顯著降低(P<0.05)，VEGF、mTOR蛋白表達均顯著升高(P<0.05)，AMPK蛋白表達雖升高，但不具有顯著性差異；與模型組比較，異鼠李素藥物干預后PI3K、AKT1蛋白表達均顯著升高(P<0.05)，VEGF和mTOR蛋白表達均顯著降低(P<0.05)，且均與陽性對照趨勢一致。實驗結果表明異鼠李素主要通過影響PI3K、AKT1、VEGF和mTOR蛋白表達從而改善HepG2細胞IR狀態。

圖9 異鼠李素對IR HepG2細胞PI3K、AKT1、VEGF、mTOR、AMPK信號通路相關蛋白表達的影響Fig.9 Effects of isorhamnetin on expression of PI3K,AKT1,VEGF,mTOR and AMPK signaling pathway related proteins in IR HepG2 注：C：對照組；M：模型組；P：陽性對照組；A：異鼠李素組。與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。Note:C:Control group;M:Model group;P:Positive group;A:Isorhamnetin group.Compared with control group,*P<0.05;Compared with model group,#P<0.05.

3 討論與結論

本文基于UHPLC-ESI-MS/MS技術的代謝組學方法對藥用黃精與食用黃精的次生代謝產物進行分析。結果共鑒定出319種次生代謝產物，包括酚酸類86種，黃酮類96種，蒽醌類5種，木脂素與香豆素25種，鞣質3種，生物堿51種，萜類11種，甾體21種，其他類21種。藥用黃精與食用黃精所含次生代謝物差異較大，PCA與HCA均可顯著區別。另藥用黃精與食用黃精比較組中共篩選出106種差異代謝物，其中上調化合物85種，下調化合物21種，藥用黃精在次生代謝產物數量與相對含量方面具有明顯優勢。為進一步比較藥用黃精與食用黃精次生代謝物的變化規律，將差異代謝物經過數據庫KEGG注釋，由KEGG分類與富集結果表明，藥用黃精在黃酮、黃酮醇、異黃酮、生物堿代謝途徑發生明顯富集，這可能與藥用黃精品質形成相關。由文獻報道可知[13]，植物在生長過程中，由于生長環境或逆境的脅迫會產生種類豐富的次生代謝產物，這些代謝產物往往具有抗旱、抵御病害、蟲害等特定的生物功能，同時這些次生代謝物的積累也有利于植物藥用部位藥效品質的提升。如：黃酮類成分的積累有利于抗氧化、抗炎、抗腫瘤功效的提高[14]；生物堿類成分積累則表現出有較高的抗肝癌作用及抑制α-糖苷酶活性的作用[15]；甾體皂苷具有多樣生物活性的成分，如抗炎，抗腫瘤等[16]。因此，在對這些差異積累的黃酮類、生物堿類以及甾體類化合物的深入分析，有利于篩選出與藥用黃精品質相關的質量標志物。

目前《中國藥典》2020年版一部黃精項下并未對黃酮、生物堿類等次生代謝產物進行含量限定。本研究對藥用黃精與食用黃精差異代謝物相對含量變化前十的化合物進行比較發現，50%的代謝物屬于黃酮類化合物，這與差異代謝物KEGG分類與富集結果一致。其中藥理活性較高的代謝物，如：異鼠李素具有較好的抗腫瘤、抗心肌缺氧、缺血，緩解心絞痛，抗心律失常，治療冠心病和高血壓，清除氧自由基，降低血清膽固醇，保護心血管，促進血流通暢等多種生物學效應，廣泛應用于臨床[17,18]；纖細薯蕷皂苷在抗腫瘤、抗菌、殺滅寄生蟲、溶血、降血脂、抗骨質疏松、抗突變等方面也有一定的生理活性[19,20]。而異鼠李素與纖細薯蕷皂苷僅在來源于黃精PolygonatumsibiricumRed.這一物種表現出明顯差異上調?；诖?，下一步可以食用黃精(水果黃精)為對照，探究來源于藥典收載的滇黃精PolygonatumkingianumColl.et Hemsl.、多花黃精PolygonatumcyrtonemaHua以及地方可藥用黃精品種(如：四川南充、重慶秀山、湖南新化等地廣泛種植的大葉黃精)干燥塊莖為實驗組，基于廣泛靶向代謝組分析各比較組次生代謝產物的變化規律，進而結合特定類別代謝物的生物活性篩選出中藥黃精品質相關代謝物，為正品黃精的品質評價與質量控制提供依據。

為了進一步驗證代謝組學篩選出的差異上調化合物的活性，本文結合黃精傳統功效健脾以及主治內熱消渴證，以IR為疾病模型進行網絡藥理分析，通過KEGG通路分析的結果可以看出：異鼠李素、野漆樹苷、異野漆樹苷3種差異上調化合物于PI3K-Akt信號通路、mTOR信號通路、VEGF信號通路、雌激素信號通路、AMPK等信號通路富集顯著性程度較高，通過對既往文獻進行查閱并分析可以發現：PI3K/AKT信號通路涉及細胞周期、細胞凋亡、細胞增殖和葡萄糖代謝，而胰島素主要作用于肌肉、肝臟和脂肪組織，它通過與胰島素受體結合來激活PI3K/AKT信號通路，從而調控葡萄糖和脂肪代謝過程[21]；mTOR信號通路通過參與調控骨骼肌葡萄糖攝入量及胰島素抵抗，通路激活可提高胰島素敏感性，然而當其過度激活時則會抑制胰島素的敏感性[22]；VEGFA作為VEGF信號通路的重要靶點蛋白，通過提高脂肪和肌肉中胰島素的敏感性來改善IR，進而控制血糖[23]；腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)是調節機體能量代謝的重要物質，研究表明多種天然化合物能激活AMPK，增強胰島素的敏感性，是改善胰島素抵抗的潛在靶點[24]。此外，黃精改善IR的作用靶點還可能通過作用于雌激素信號通路等相關通路，調節垂體-腎上腺軸及其他組織器官，直接或者間接起到了改善IR的作用[25]。以上研究結果與文獻報道單體成分異鼠李素治療糖尿病結果一致[26]。另通過分子對接技術進一步揭示黃精對改善IR的功效的作用機制，結果顯示PI3K-Akt信號通路、mTOR信號通路、VEGF信號通路、雌激素信號通路、AMPK等信號通路關鍵靶點與異鼠李素、野漆樹苷、異野漆樹苷對接效果好，結合能均≤-20.9 kJ/mol。因此推測黃精活性成分與關鍵靶點的結合可能是黃精發揮治療IR的關鍵。通過進一步的細胞實驗驗證發現差異代謝物中異鼠李素可以有效改善HepG2細胞IR狀態，主要通過影響PI3K、AKT1、VEGF和mTOR信號通路相關蛋白的表達，結果表明異鼠李素可以使IR HepG2細胞PI3K、AKT1蛋白表達水平升高，VEGF、mTOR蛋白表達水平降低。

綜上所述，本文通過廣泛靶向代謝組學技術準確、全面地鑒定了藥用與食用黃精中的次生代謝物，藥用黃精與食用黃精相比差異上調化合物異鼠李素等通過PI3K、AKT1、VEGFA和mTOR等核心靶點作用于PI3K、AKT1、VEGF和mTOR等信號通路起到了改善IR的目的，充分體現了中藥多成分-多靶點-多途徑的藥效特點。該研究結果為黃精活性成分的篩選與品質評價奠定了基礎、為闡述黃精治療IR作用機制提供了依據。