費城染色體陰性骨髓增殖性腫瘤患者非驅動基因突變分布及臨床特征分析

趙一帆，林紹澤，陳怡佳，許林純，邢學仰，陶紅芳，蘇永忠

（1．汕頭大學醫學院第一附屬醫院血液科，廣東 汕頭 515041；2．綿陽市中心醫院血液科，四川 綿陽 621000）

骨髓增殖性腫瘤（myeloproliferative neoplasm，MPN）是起病于多能造血干細胞層面的一組疾病的統稱，主要表現為一系或多系血細胞數量和質量的異常，同時出現肝脾腫大、血栓或出血事件等臨床表現[1]。臨床上MPN主要包括真性紅細胞增多癥（polycythemia vera，PV）、原發性血小板增多癥（essential thrombocythemia，ET）、原發性骨髓纖維化（primary myelofibrosis，PMF）三種類型[2]。目前的研究[3-5]確定了JAK2、CALR、MPL三種驅動基因在MPN發病機制具有重要作用，超過95%的PV患者和90%的ET或PMF患者表達三種驅動基因突變中的至少一項，但約有10%的ET和PMF患者上述三種驅動基因突變均無法檢測出，這類患者被稱為“三陰性”突變型[6]。而隨著近年來二代基因測序等檢測手段的普及，多種非驅動基因突變在MPN患者中被發現，包括ASXL1、EZH2、SRSF2、IDH1/2在內的高危基因突變及TP53、TET2、DNMT3A等基因突變均被認為與MPN患者預后不良及白血病的轉化有關[7-8]。本研究對123例初診的MPN患者進行常見非驅動基因的檢測，旨在了解MPN患者非驅動基因表達頻率并分析其臨床特征差異性。

1 資料與方法

1.1 研究對象

收集2018年1月—2020年12月于汕頭大學醫學院第一附屬醫院住院就診的123例初診MPN患者的臨床資料，所有患者均符合2016年世界衛生組織制定的PV、ET、PMF診斷標準[2]。其中男性63例，女性60例，中位年齡58歲（17～85歲），其中PV、ET、PMF分別為31例、65例及27例。本研究經汕頭大學醫學院第一附屬醫院倫理委員會審查批準。

1.2 分析方法

采用病例回顧性分析方法，收集123例患者初次住院時的外周血常規、影像學、骨髓細胞學、骨髓組織病理、既往血栓病史等資料。所有患者均已通過二代測序的方式進行MPN相關28種基因突變檢查。

1.3 統計學分析

采用SPSS 22.0軟件進行分析。正態分布的計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析或獨立樣本t檢驗。非正態分布的計量資料以中位數和四分位數間距[M(Q1，Q3)]表示，組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗或Mann-WhitneyU檢驗。計數資料采用卡方檢驗、Fisher精確檢驗法等方法檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料

3組患者的性別構成、年齡及并發血栓事件例數差異無統計學意義（P值均＞0.05）。相比PMF和ET患者，PV患者具有更高的血紅蛋白值（P＜0.001）和紅細胞壓積水平（P＜0.001）。ET患者則表現出更高的血小板計數（P＜0.001）。PMF患者的白細胞計數（P=0.021）、乳酸脫氫酶水平（P=0.022）相對更高，并且具有出更多的骨髓原始細胞數（P=0.011）和更嚴重的骨髓纖維化（P＜0.001），同時也更容易合并肝臟（P=0.004）或脾臟腫大（P＜0.001），見表1。

表1 MPN患者一般情況及臨床特征

2.2 基因突變檢出概況

在全部123例患者中，總共檢測出21種共201項基因突變，平均每例患者表達（1.63±0.98）項基因突變。86.99%的患者至少檢測出1種驅動基因突變（JAK2、CALR和MPL），68.29%的患者檢測出JAK2基因突變，16.26%的患者檢測出CALR基因突變，4.88%的患者檢測出MPL基因突變，分別有2例和1例PV患者同時檢測到JAK2/CALR和JAK2/MPL基因突變。在非驅動基因的檢測中，52.85%的患者可檢測到至少1種非驅動基因突變，其中、PV、ET和PMF組患者人均表達非驅動基因0（0，1）、1（0，1）、1（0，2）項，3組間差異具有統計學意義（P=0.029），兩兩比較時ET和PMF組人均表達非驅動基因數均多于PV組患者，差異有統計學意義（P=0.047，P=0.011）。見圖1。

圖1 123例MPN患者基因突變分布情況

2.3 MPN患者有無非驅動基因突變臨床特征的差異性分析

對比可檢測到≥1種非驅動基因突變和未檢測到非驅動基因突變的兩組患者臨床特征可發現，表達非驅動基因突變的患者中女性占比更高（P=0.023），年齡更大（P=0.022），白細胞計數（P=0.016）更高，血紅蛋白水平（P=0.010）、紅細胞壓積（P=0.014）、血小板計數（P=0.043）更低，同時伴有更高的乳酸脫氫酶水平（P=0.030），見表2。

表2 MPN患者有無非驅動基因突變臨床特征分析

2.4 MPN患者有無高危基因突變臨床特征的比較

在全部123例患者中，表達包括ASXL1、EZH2、IDH1/2、SRSF2在內的高危基因突變患者占比為20.33%，對比高危基因突變和未表達高危基因突變的兩組患者，可發現高危基因突變的患者以女性為主（P=0.031），通常年齡更大（P=0.024），具有血紅蛋白水平（P=0.021）、紅細胞壓積（P=0.037）、血小板計數（P=0.043）更低，同時乳酸脫氫酶水平更高、纖維化更嚴重的特點，見表3。

2.5 MPN患者有無TET2基因突變的臨床特征差異性分析

PV、ET和PMF組分別有7例、13例和8例患者發生TET2基因突變，3組之間TET2基因突變的發生率差異無統計學意義。相比于無TET2基因突變的患者，發生TET2突變的患者具有更高的白細胞計數（P=0.001），更低的血紅蛋白水平（P=0.047）、更高的乳酸脫氫酶水平（P＜0.001）及更嚴重的骨髓纖維化（P=0.021），同時也有更多患者出現脾臟腫大的臨床特征（P=0.018），見表4。

表4 MPN患者有無TET2基因突變的臨床特征分析

3 討論

骨髓增殖性腫瘤存在極強的異質性，根據美國梅奧診所一項納入3 023例MPN患者的生存預后研究顯示，PMF相比于PV、ET具有明顯更短的中位生存時間[9]。而MIPSS70、MIPSS70 plus等預后分層系統下不同危險度的PMF患者中位生存時間相差最多可達到25.4年[10]。因此對于MPN患者來說，精準診斷及危險度分層對于患者治療方案選擇及預后判斷十分重要。明確JAK2、CALR及MPL等驅動基因和ASXL1、TET2、TP53、SRSF2等非驅動基因在MPN患者的表達狀態，利用基因突變結果，結合年齡、體質性癥狀、血細胞計數等因素綜合判斷預后危險程度，并據此選擇有效的個性化治療方式變得越來越重要[6]。

本研究86.99%的MPN患者檢測出JAK2、CALR、MPL三種驅動基因突變中的一種，驅動基因檢出率較國內其他研究[11]稍低，考慮與檢測方法存在差異及樣本量偏少有關。值得一提的是，在PV患者中，本研究分別檢測出2例和1例患者同時表達JAK2/CALR和JAK2/MPL基因突變，這種現象在國內目前僅有少量個案報道[12]。

目前的研究顯示，MPN患者中出現的非驅動基因突變已經超過50種[6，13]，可通過干擾DNA甲基化、修飾染色質、影響信號傳導通路及轉錄過程等多種方式導致MPN的發生[14-15]。其中突變率較高并且對MPN患者預后具有指導價值的非驅動基 因 主 要 包 括TET2、ASXL1、TP53、SRSF2、EZH2、U2AF1及IDH1/2等[16-17]。本 研 究 發 現TET2、ASXL1、TP53的表達概率相對更高。發生非驅動基因突變的MPN患者以女性為主，并多伴隨年齡更大、白細胞更高以及血紅蛋白、血小板水平更低的臨床特點。自2011年開始，研究報道表達EZH2、SRSF2、IDH1/2、RAS等基因突變的MPN患者可表現出更短的總生存時間及更快的白血病轉化速度[18-20]。而在2014年，Tefferi等[21]研究發現，相比較于原有的血細胞計數、年齡、不良核型的預后指標，聯合分析ASXL1和CALR基因的突變狀態可更加有效地預測PMF患者預后，并證實ASXL1基因突變在患者預后中具有負性調控作用。隨后Guglielmelli等[8]的研究指出，以ASXL1、EZH2、SRSF2、IDH1/2組成的高危基因突變能有效預測患者生存時間及白血病轉化風險，對比無高危基因突變的患者，高危基因突變的患者總生存時間縮短超過一半；而白血病轉化風險則增加3.3倍，并且隨著高危基因突變表達數量增加而愈發明顯。另外，發生高危基因突變的患者還反應出了更明顯的體質化癥狀和更嚴重的骨髓纖維化程度[22]。本研究統計后發現相比無高危基因突變的MPN患者，高危基因突變的患者中女性占比更高，具有年齡更大，血紅蛋白、血小板計數更低的特點，同時反應腫瘤負荷的指標如乳酸脫氫酶水平更高、纖維化程度更嚴重。此外，在隨訪中已發現2例高危基因突變的患者分別在確診PMF 9、13個月后轉化為急性白血病。

根據目前的研究顯示，TET2是眾多非驅動基因中發生突變頻率最高的基因，在PV、ET和PMF患者中分別可達到7%～16%、19%～22%及10%～18%[18]，而在最終轉化為急性白血病的MPN患者中，TET2基因的突變率可高達19%～28%[23]。本研究的MPN患者共檢測出28例發生TET2基因突變，其在PV、ET和PMF患者中的突變率分別為22.58%、20.00%及28.57%，略高于國內外研究的結果。目前TET2基因突變在MPN的發病機制中的作用暫未明確。一項法國的研究[24]通過對存在ATG2B/GSKIP基因突變的患者及12個無癥狀攜帶者進行基因篩查及隨訪，發現75%的健康攜帶者出現早期克隆性造血的現象，MPN驅動事件的克隆性優勢在1/2的病例中與TET2突變相關，在1/3的病例中與影響剪接和（或）RAS通路的突變相關，共同導致MPN的早期發展，主要是原發性血小板增多癥，且具有高轉化風險。也有研究[25]認為TET2基因突變對于造血祖細胞早期分化可與JAK2基因突變發生協同作用，使造血干細胞增加自我更新信號的應答，并向粒單核細胞分化傾斜。以上研究推測TET2突變后增強了造血干細胞自我更新的能力，并加速髓系細胞的分化程度，促進了MPN的起病[26]。有意思的是，Ortmann等[27]指出TET2與JAK2基因在患者病程中發生突變的順序可能影響疾病發展方向，先發生TET2后出現JAK2基因突變的MPN患者更傾向于ET表型，反之則更傾向于PV表型。本研究中伴隨TET2基因突變的患者更加容易出現白細胞升高、血紅蛋白降低、脾臟腫大及骨髓纖維化的臨床特征。

非驅動基因在MPN的發病中具有重要作用。也有研究[28]指出EZH2的突變缺失通過H3K27甲基化水平的降低，導致其他癌基因異常表達并進一步促進惡性腫瘤的發生。EZH2具有與JAK2突變協同誘導腫瘤產生的作用，在小鼠實驗中，誘導出現EZH2和JAK2基因雙突變的小鼠表現出了骨髓纖維化程度增加，紅細胞分化受損，髓系祖細胞和巨核系祖細胞增殖并引起外周血中血小板和白細胞增多的典型MPN樣表現[29]。Guglielmelli等[30]的研究發現EZH2基因突變在PMF患者中具有預后不良的作用，EZH2基因突變的患者在初診時即出現更高的白細胞、原始細胞及巨脾等表現，在隨訪過程中無白血病轉化時間及總生存時間均較無EZH2基因突變的患者縮短。在小鼠模型的動物實驗中，SRSF2的表達會導致髓系細胞特別是巨核系細胞分化偏倚，B細胞的發育和成熟度受損，以及造血干細胞數量的減少，并且導致MPN的發生[31]。IDH1/2突變誘發惡性腫瘤的機制主要在于IDH1/2突變后增加了2-羥基戊二酸的產生并通過組蛋白去甲基化的過程，阻止可誘導的譜系特異性分化基因的表達導致分化受阻[32]。有研究[33]報道IDH1/2在白血病轉化中的突變率明顯高于慢性期MPN，這提示了IDH1/2突變對于MPN的白血病轉化具有重要作用。同時IDH2突變的存在還被證明增強了SRSF2異常剪接基因的表達，進一步導致基因組不穩定并增加白血病轉化風險，突顯了不同突變之間的互相干擾。

綜上所述，本研究發現表達了非驅動基因尤其是包含了ASXL1、EZH2、SRSF2、IDH1/2等高危基因突變的MPN患者多具有更重的腫瘤負荷，合并貧血、血小板減少的概率較高。結合相關研究可知，TET2、EZH2、IDH1/2、SRSF2基因的表達與MPN的發生發展息息相關。如能繼續追蹤發生非驅動基因突變的患者的預后，將能進一步明確非驅動基因突變對于MPN患者生存時間、血栓事件并發癥等方面的影響，或許能起到指導分層診治的作用。