miR-142-3p對膀胱癌細胞增殖和有氧糖酵解的影響及作用機制

沈翀 閻家駿 任煜

膀胱癌（bladder cancer,BC）是世界范圍內常見腫瘤之一。隨著人口增長和老齡化的增加，BC發病率呈逐年上升趨勢，每年新增約55萬病例[1]。根據腫瘤侵犯是否超過膀胱肌層可將BC分為肌層浸潤型和非肌層浸潤型，隨著醫療科技水平的提高，不同類型BC的治療方式都有了很大改進，術后患者生存率也有了極大提高[2-3]。但BC的進展預測和術后復發仍是目前臨床難點，亟需尋找新的臨床標志物或治療策略。微小RNA（micro-RNA,miR）是一類非編碼RNA，能在腫瘤細胞信號通路中起信號阻遏或激活作用，并調控腫瘤細胞有氧糖酵解[4-6]。現階段研究認為，miR的異常表達與泌尿系統腫瘤發生及進展相關[7-8]，故極有潛力作為BC的治療靶點和預后標志物。研究表明，miR-142-3p在BC細胞及組織內低表達，與BC細胞增殖、遷移、侵襲能力增強有關[9-11]，但miR-142-3p對BC的有氧糖酵解作用未知。本研究利用體外BC細胞轉染miR-142-3p，以明確miR-142-3p對BC細胞增殖和糖酵解的影響，并探究其可能的作用靶點。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗細胞人輸尿管上皮細胞株SV-HUC-1和人BC細胞株SW780、UMUC3、T24、BIU87均購自賽百慷生物技術有限公司；使用含10 % FBS的培養基，在37℃、5%二氧化碳（CO2）條件下培養。每1～2 d進行細胞傳代，取對數生長期細胞進行實驗。

1.1.2 試劑RPMI1640培養基購自美國Hyclone公司，批號：AE29 163439；CCK-8試劑盒購自美國MCE公司，批號：092820 210318；葡萄糖和乳酸含量微量法檢測試劑盒、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid,BCA）蛋白定量試劑盒、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自中國索萊寶科技有限公司，批號分別為20210711、20210813、20210623、20 210808；細胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent kinase,CDK）4、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase,LDH）A、磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）蛋白抗體購自美國Affinity公司，批號分別為38f4541、47o1025、25s1685；細胞周期試劑盒購自美國BD公司，批號：9 312877；逆轉錄試劑盒購自中國康為世紀科技股份有限公司，批號：36320；2-NBDG葡萄糖攝取實驗試劑盒購自美國Abcam公司，批號：GR3347285-12。

1.2 方法

1.2.1 5組細胞miR-142-3p表達的檢測采用qPCR法。5組細胞分別加入Trizol勻漿管中裂解，提取RNA。42℃，15 min；85℃，5 min，進行逆轉錄反應。miR-142-3p引 物 為F：5'-CAAACTCAAGGAGCAACACCG-3'，R：5'-TAAGTGTAGTAAACCACTCGTG-3'；U6引物為F：5'-GATTATCGGGACCATTCCACTG-3'，R：5'-GATCTGGTTCCCAATGACTGTG-3'。95℃，10 min變性；95℃，15 s；60℃，60 s條件下循環40次。U6作為內參，采用2-ΔΔCt法分析計算各組細胞miR-142-3p相對表達量。選取極低表達miR-142-3p的細胞進行后續實驗。

1.2.2 miR-142-3p質粒構建、轉染及表達檢測美國國家生物信息中心（national center for biotechnology information,NCBI）數據庫獲取miR-142-3p基因序列，PCR法擴增序列，雙酶切法將基因片段和空白質粒連接構建miR-142-3p質粒。將空白質粒和miR-142-3p質粒轉染至選取的細胞內，5種細胞均各分為質粒對照組和miR-142-3p轉染組，正常培養24～48 h。采用qPCR法測定各組細胞miR-142-3p相對表達量。

1.2.3 細胞克隆的檢測采用平板克隆實驗。將轉染后的細胞消化制成細胞懸液，接種于含30%FBS的完全培養基的12孔板中。孔中單克隆細胞數量＞50個時，PBS洗滌細胞，4%多聚甲醛固定1 h。PBS清洗細胞，純凈結晶紫染液染色2 min，拍照并計數細胞克隆數量。

1.2.4 細胞活性的檢測采用CCK-8法。將轉染后的細胞制備懸液，接種于96孔板中培養24 h。按照CCK-8試劑盒方法加入CCK-8試劑，繼續于培養箱內孵育24 h。完成后取出，檢測450 nm處各孔細胞吸光度（optical density，OD），根據公式計算細胞存活率。細胞存活率（%）=（實驗組OD450-空白組OD450）/（對照組OD450-空白組OD450）。

1.2.5 細胞周期檢測采用流式細胞術。PBS清洗轉染后的細胞，消化細胞，待消化結束時血清培養基終止反應。1 000 r/min離心3 min，棄上清液。1 ml PBS重懸細胞，1 000 r/min離心3 min，棄上清液。500 μl DNA染液和5 μl破膜劑，室溫避光孵育細胞30 min，離心，吸棄300 μl上清液。PBS重懸細胞，過300目濾膜，移至新離心管。使用流式細胞儀計數不同周期的細胞數量及比例。

1.2.6 細胞糖酵解的檢測（1）細胞葡萄糖攝取能力的檢測：采用2-NBDG攝取實驗，按照葡萄糖檢測試劑盒方法，將轉染后的細胞接種于96孔板孵育48 h后，加入2-NBDG孵育10 min。在激發波長/發射波長（Ex/Em）為488/520的條件下測定熒光值。以各組熒光強度/空白值表示細胞葡萄糖消耗量。（2）細胞乳酸生成量的檢測：按照乳酸含量檢測試劑盒方法檢測細胞的乳酸生成量。

1.2.7 miR-142-3p與CDK4、LDHA靶向性預測及驗證使用Target Scan（https://www.targetscan.org/）進行miR-142-3p與野生（wild-type,WT）型和變異（mutate,Mut）型的CDK4、LDHA基因靶向預測。采用雙熒光酶報告基因檢測試劑盒進行靶向性驗證。miR-142-3p質粒轉染后的細胞預先鋪板培養16 h，構建WT、Mut型的CDK4-3'端非翻譯區（3'UTR）和LDHA-3'UTR的熒光素酶報告質粒，轉染至鋪板細胞中，6 h更換1次培養基。48 h后，裂解細胞并加至黑色酶標板中，加入檢測反應液共培養30 min，測定報告質粒熒光值，進行miR-142-3p與CDK4、LDHA的靶向性驗證。

1.2.8 CDK4與LDHA表達的檢測采用Western blot法。PBS清洗并收集低表達miR-142-3p細胞及miR-142-3p轉染后的細胞。使用RIPA裂解液裂解細胞，4℃，12 000 g離心5 min，提取上清液。按照BCA蛋白定量試劑盒方法檢測樣品中總蛋白濃度。聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉至聚氟乙烯膜（PVDF），5%脫脂奶粉振蕩孵育2 h，洗滌緩沖液清洗。將PVDF膜放入含有CDK4與LDHA抗體的稀釋液中，4℃振蕩過夜。TBST清洗，加二抗。增強化學發光法顯影，chemi capture軟件拍照并分析，計算各組細胞中CDK4與LDHA的相對表達量。

1.2.9 CDK4與LDHA的質粒構建、過表達及相應檢測采用PCR法擴增CDK4和LDHA基因序列，構建CDK4、LDHA質粒。miR-142-3p轉染的BC細胞分為miR-142-3p+空白載體組、miR-142-3p+CDK4組、miR-142-3p+LDHA組，將空白質粒、CDK4過表達質粒和LDHA過表達質粒分別轉染至對應組別細胞中，培養24～48 h。采用2-NBDG攝取實驗，有氧糖酵解產物檢測，CCK-8實驗測定各組細胞2-NBDG熒光值、葡萄糖消耗量、乳酸生產量和細胞活性。

1.3 統計學處理使用SPSS 16.0統計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Tukey檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-142-3p在5組細胞中表達的比較與SVHUC-1細胞相比，miR-142-3p在BIU87、SW780細胞中顯著低表達（均P＜0.05），在UMUC3細胞和T24細胞中極顯著低表達（均P＜0.01），見表1。故本研究選取T24、UMUC3細胞構建過表達miR-142-3p的BC細胞株進行后續實驗。

表1 miR-142-3p在5組細胞中表達的比較

2.2 miR-142-3p對UMUC3和T24細胞增殖影響的比較與質粒對照組相比，miR-142-3p轉染組的T24和UMUC3細胞miR-142-3p相對表達量顯著升高（均P＜0.01），細胞克隆數顯著減少（均P＜0.01），細胞存活率在24 h及之后顯著下降（P＜0.05），見圖1。

2.3 miR-142-3p轉染對UMUC3和T24細胞周期影響的比較與質粒對照組相比，miR-142-3p轉染組的T24和UMUC3細胞滯于G0/G1期細胞比例顯著增加（均P＜0.01），而滯于S期和G2/M期的細胞比例明顯下降（P＜0.05），見圖2。

圖2 過表達miR-142-3p對2種BC細胞周期的影響（a：流式細胞術檢測細胞周期；b：過表達miR-142-3p的2種BC細胞不同細胞周期細胞比例）

2.4 miR-142-3p對UMUC3和T24細胞有氧糖酵解影響的比較與質粒對照組相比，miR-142-3p轉染組T24、UMUC3細胞的2-NBGD熒光強度顯著減弱、葡萄糖消耗量顯著下降（均P＜0.01），乳酸生成量顯著下降（P＜0.01），見圖3。

圖3 過表達miR-142-3p對2種BC細胞有氧糖酵解的影響（a：過表達miR-142-3p對2種BC細胞2-NBDG熒光強度的影響；b：過表達miR-142-3p對2種BC細胞葡萄糖消耗量的影響；c：過表達miR-142-3p對2種BC細胞乳酸生成量的影響）

2.5 miR-142-3p與不同型CDK4和LDHA基因靶向性預測及驗證miR-142-3p與野生型的CDK4和野生型LDHA基因的部分基因序列靶向關聯。與質粒對照組相比，miR-142-3p轉染組的野生型CDK4和LDHA熒光素酶報告質粒的熒光素酶相對活性顯著降低，差異均有統計學意義（均P＜0.01），而變異型熒光素酶報告質粒的熒光酶相對活性無明顯變化（均P＞0.05），見圖4。

圖4 miR-142-3p與不同型CDK4和LDHA基因序列的靶向預測及驗證（a：miR-142-3p與不同型CDK4和LDHA基因的預測結果；b：不同型CDK4或LDHA與miR-142-3p結合后熒光素酶活性的影響）

注：miR為微小RNA；BC為膀胱癌；*P＜0.05，**P＜0.01

2.6 miR-142-3p對UMUC3和T24細 胞CDK4和LDHA蛋白表達的影響與質粒對照組相比，miR-142-3p轉染組T24和UMUC3細胞CDK4和LDHA蛋白的相對表達量顯著降低，差異均有統計學意義（均P＜0.01），見圖5。

圖5 過表達miR-142-3p對2種BC細胞有氧糖酵解相關蛋白表達的影響（a1和b1：蛋白電泳圖；a2和b2：過表達miR-142-3p對2種BC細胞CDK4、LDHA蛋白表達的影響）

2.7 CDK4和LDHA過表達對miR-142-3p轉染T24細胞的影響與miR-142-3p+空白載體組相比，miR-142-3p+CDK4組和miR-142-3p+LDHA組細胞的2-NBDG熒光強度顯著增強（P＜0.01）、葡萄糖消耗量顯著上升（P＜0.01），乳酸生成量顯著上升（P＜0.01），48 h及之后細胞存活率顯著上升（P＜0.01），見圖6。

圖6 過表達CDK4或LDHA對miR-142-3p轉染T24細胞糖酵解、增殖的影響（a：過表達CDK4或LDHA對miR-142-3p轉的T24細胞2-NBDG熒光強度的影響；b：過表達CDK4或LDHA對miR-142-3p轉染的T24細胞葡萄糖消耗量的影響；c：過表達miR-142-3p對2種BC細胞乳酸生成量的影響；d：過表達CDK4或LDHA對miR-142-3p轉染的T24細胞存活率的影響）

3 討論

“瓦博格效應”為腫瘤細胞優先選擇低效產能的糖酵解途徑來滿足快速代謝需求，表現為腫瘤細胞較正常細胞需攝取更多葡萄糖，生成更多乳酸，而過量的乳酸能夠提供腫瘤細胞增殖和線粒體代謝[12-13]。據此，靶向有氧糖酵解途徑的各種關鍵酶及相關轉運蛋白以抑制腫瘤細胞增殖為腫瘤治療帶來了新的方向[14-15]。本研究發現miR-142-3p在BC細胞中顯著低表達，提示miR142-3p在BC細胞中極可能具有抑癌作用。

既往研究表明，miR-142-3p通過調控BC細胞周期變化、誘導凋亡，抑制細胞的增殖和侵襲[8-10]。本研究將構建的miR-142-3p質粒轉染BC細胞系的T24和UMUC3細胞后，2種BC細胞活性及克隆增殖能力均顯著下降，細胞周期阻滯于G0/G1期，驗證了miR-142-3p具有調控BC細胞周期、抑制細胞增殖的作用。本研究發現miR-142-3質粒轉染能夠減弱BC細胞的2-NBDG葡萄糖熒光強度，減少細胞葡萄糖消耗及乳酸生成，提示miR-142-3具有抑制BC細胞攝取葡萄糖、調控有氧糖酵解的作用。

腫瘤細胞的快速增殖依賴于大量能量物質，而糖酵解正是腫瘤細胞異常能量需求的主要來源[14，16]。研究顯示miR-142-3p能夠通過調節有氧糖酵解抑制腫瘤細胞的侵襲和遷移能力[17]。生物體內的有氧糖酵解途徑涉及多過程，并有多種酶的參，LDHA是糖酵解途徑中的關鍵酶，還可參與腫瘤免疫微環境的調控，與腫瘤的發生、發展極為密切[5，18]。研究表明，LDHA可在miR的調控下影響腫瘤細胞糖代謝，起到抑制細胞增殖的作用[19]。Hua等[20]發現miR-142-3p可以靶向LDHA調控有氧糖酵解抑制肝癌細胞的增殖和轉移。CDK4是調控是腫瘤細胞從G1期進入下一細胞周期的重要信號分子，而有氧糖酵解可為腫瘤細胞周期改變提供所需能量[21]。研究顯示，乳腺癌細胞對CDK4抑制劑的耐藥性增加可導致細胞的有氧糖酵解加強[22]。研究表明，miR-142-3p能夠靶向CDK4調控腫瘤細胞周期[23]。基因多態性與癌癥相關[24]，野生型基因是自然界中最常見的基因類型。本研究發現，miR-142-3p能與野生型的CDK4和野生型的LDHA基因結合，且過表達miR-142-3p可抑制BC細胞CDK4和LDHA的蛋白表達，提示CDK4和LDHA是miR-142-3p的作用靶點。如前所述，CDK4或LDHA的表達可促進腫瘤細胞增殖，LDHA可增強腫瘤細胞糖酵解[20]，而LDHA和CDK4對BC細胞糖酵解的作用還未明確。本研究比較了過表達CDK4或LDHA對miR-142-3p轉染T24細胞有氧糖酵解和活性的影響，結果顯示，CDK4或LDHA過表達能夠上調miR142-3p轉染的T24細胞的葡萄糖攝取能力，增加細胞的葡萄糖消耗量和乳酸生成量，并促進細胞的活性，表明CDK4或LDHA表達可促進BC細胞的有氧糖酵解和增殖、逆轉miR-142-3p對BC細胞糖酵解和增殖的抑制。而miR-142-3p可抑制BC細胞CDK4和LDHA蛋白的表達，故通過本實驗結果可推測miR-142-3p通過靶向抑制CDK4和LDHA表達發揮對BC細胞增殖和糖酵解的抑制作用。

綜上所述，本研究明確了miR-142-3p可通過靶向LDHA和CDK4抑制膀胱癌細胞的增殖和有氧糖酵解，為miR-142-3p可作為抑制BC細胞有氧糖酵解的治療靶點提供了潛在依據。但本研究僅在體外開展了初步研究，后續還需要更多研究進一步明確miR-142-3p對膀胱癌的治療作用，以及預后價值。