Avagacestat抑制破骨細胞形成及溶骨功能改善骨關節炎骨破壞

何佳嘉，張 平，周薇娜，江宏兵

骨關節炎(osteoarthritis, OA)是一種常見的影響整個關節肌肉骨骼結構的退行性疾病，其特點是關節軟骨和軟骨下骨均發生進行性破壞[1-2]。關節軟骨的完整性依賴于軟骨下骨，在OA相關的骨代謝改變中，破骨細胞活性增加被認為是OA發展過程中軟骨變性的早期促發因素[3]。在骨關節炎的早期階段，破骨細胞活性升高致使軟骨下骨密度顯著減低、骨與軟骨連接處結構的完整性喪失，并促進軟骨變性發生[4-6]。

破骨細胞作為一種獨特的、高度特化的多核巨細胞，具有顯著的降解礦化骨和軟骨基質的能力，通過分泌酸和蛋白酶降解骨基質，如抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase， TRAP)和組織蛋白酶K參與破骨活動[7-8]，多種信號通路參與了此過程的調節，其中NOTCH相關信號通路，作為細胞分化成熟相關的信號通路，通過與腫瘤壞死因子α轉換酶(tumor necrosis factor α-covertinng enzyme，TACE)、γ-分泌酶相互反應，調節κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)，進而參與破骨細胞分化成熟及骨破壞的過程[9-12]。

Avagacestat是一種γ-分泌酶選擇性抑制劑，既往研究報道提示其具有調節NOTCH信號通路的作用[13]，但其是否可以抑制破骨細胞形成及骨溶解進而對骨關節炎有潛在治療價值未見報道。本研究中，我們通過體外細胞實驗及體內脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)誘導OA模型，證實Avagacestat抑制破骨細胞形成并可進一步減少溶骨活動。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和試劑

25只雄性6周齡C57 SPF級小鼠，α-MEM完全培養基，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(Gibco，美國)，胰蛋白酶(Sigma，美國)，青/鏈霉素，Trizol(Invitrogen，美國)，反轉錄試劑盒(Takara，日本)，巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)，TRAP染色液(Merck，德國)，Avagacestat(Selleck，BMS-708163，美國)，骨板(Osteo Assay Surface plates, Corning，美國)，SYBR RT-PCR試劑盒(Takara Bio，美國)，Revert Aid cDNA合成試劑盒(Thermo Fisher Scientific，美國)。

1.2 方法

1.2.1 骨髓巨噬細胞(bone marrow macrophages，BMMs)獲取和培養 從6周齡C57雄性小鼠股骨和脛骨中分離BMMs，小鼠脫頸處死后，75%乙醇溶液浸泡5 min；剝離股骨與脛骨外軟組織，眼科剪剪開股骨與脛骨兩端，暴露髓腔；使用含10% FBS的α-MEM完全培養基反復沖洗髓腔5次，收集骨髓懸液經過濾、離心、紅細胞裂解等步驟后獲得骨髓細胞，重懸細胞后，加入M-CSF誘導液至終濃度30 μg/L，隔日換液，至80%以上細胞貼壁，得到原代骨髓巨噬細胞BMMs；取原代BMMs[14]，將細胞置于含10% FBS的α-MEM完全培養基中，用100 μg/L RANKL和33.3 μg/L M-CSF刺激細胞分化，進行培養[15]。所有動物實驗均按照國際實驗動物護理與使用指南進行，并獲得南京醫科大學醫學倫理委員會的批準(實驗倫理編號：IACUC-2006014，飼養協議/合同編號：SY-20200145)。

1.2.2 細胞毒性測定 采用CCK8法測定Avagacestat的細胞毒性。將BMMs接種到96孔板中(1×104個/孔)，將含有用100 μg/L RANKL和33.3 μg/L M-CSF的誘導液培養基中加入不同濃度的Avagacestat(0、1、2、4、16、32、64、160、320、640、1 280、2 560 nmol/L)。處理后，不同孔板BMMs分別孵育不同時間點(24、48、96 h)。實驗結束時，每孔加入100 μL 10% CCK8溶液，37 ℃孵育2 h后Varioskan LUX多功能酶標儀檢測460 nm波長下光密度，使用Excel繪制不同藥物濃度不同時間的細胞活性曲線圖，并得到曲線方程式，取50%細胞活性對應的藥物濃度為IC50濃度。

1.2.3 破骨細胞形成實驗 取BMMs，擴增后接種在96孔板中(1×104個/孔)，使用含100 μg/L RANKL、33.3 μg/L M-CSF和不同濃度(0、120和240 nmol/L)的Avagacestat，每48 h更換1次培養基，持續6 d。對照組觀察到破骨細胞后，用4%多聚甲醛固定；在37 ℃條件下，每孔加入TRAP染色液60 μL，染色1 h。TRAP陽性細胞至少有3個細胞核被認為是破骨細胞。拍照后使用Image J軟件進行細胞計數，并作統計學分析。

1.2.4 實時熒光定量RT-PCR分析 誘導后的破骨細胞接種于6孔板，加入0、120和240 nmol/L三種濃度的Avagacestat，培養4 d，PBS洗凈后使用Trizol提取總RNA，測定總RNA濃度。使用逆轉錄試劑盒進行cDNA的合成。使用SYBR RT-PCR試劑盒進行實時熒光定量RT-PCR，實驗步驟按照說明書進行，以GAPDH內參基因為檢測C-fos、Cath-K、TRAP等基因的相對表達量，相關引物見表1。

1.2.5 破骨細胞溶骨功能實驗 BMMs接種于6孔板中(2×106個/孔)，1 d后，使用含100 μg/L RANKL、33.3 μg/L M-CSF培養至可觀測到破骨細胞。將破骨細胞按1×104個/孔接種于Osteo Assay Surface plates骨板中，培養基中加入同前濃度的RANKL和M-CSF及不同實驗濃度的Avagacestat(0、120和240 nmol/L)，培養4 d。觀察拍照，對比分析。

1.2.6 構建LPS誘導骨關節炎小鼠模型行骨吸收實驗 本實驗所有動物實驗均在南京醫科大學動物中心動物護理和使用委員會的監督下，按照ARRIVE的指導方針進行的。雄性C57小鼠(6周齡)隨機分為3組：假手術組(PBS)、LPS組和LPS+Avagacestat加藥組。異氟烷氣體麻醉小鼠后，3組小鼠膝關節分別局部注射PBS(10 mg/kg)、LPS(100 μL)、溶有Avagacestat(240 nmol/L)的LPS(100 μL)，持續2周。實驗期間未見明顯不良反應或毒性反應。小鼠的體重沒有明顯下降亦未見小鼠死亡。異氟烷氣體深度麻醉后脫頸法處死小鼠,切除膝關節并用4%多聚甲醛固定48 h。采用高分辨率Micro-CT(μCT-100 SCANCO Medical AG,瑞士)進行微計算機斷層掃描。掃描分辨率為10 μm，X射線能量被設定為70 kV、200 μA，固定曝光時間為300 ms，后對包含脛骨平臺的整個軟骨下骨進行觀察分析。

1.2.7 組織切片HE染色及TRAP標記 多聚甲醛固定的小鼠膝關節在10% EDTA中脫鈣2周，并包埋在石蠟中。然后，將樣本切成特定的切片(厚度4 μm)，進行HE和TRAP染色，使用光學顯微鏡獲得圖像。

1.3 統計學分析

2 結 果

2.1 Avagacestat抑制破骨細胞生長

CCK8實驗表明，BMMs細胞在加入Avagacestat后，細胞的增殖受到了抑制，且隨藥物濃度增加，細胞增殖受抑制更加顯著(圖1A)，計算得出在24、48、96 h的半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50)分別為493、426、405 nmol/L，證實Avagacestat對BMMs誘導分化為破骨細胞的過程具有抑制作用。為了進一步探究Avagacestat對破骨細胞功能的抑制作用，同時避免因抑制作用過強而影響實驗觀察，因而選取小于IC50的濃度來設置分組。利用TRAP實驗檢測0、120、240 nmol/L 3組濃度Avagacestat對破骨細胞形成的影響，隨著Avagacestat濃度升高，破骨細胞形成數量減少，Dunnett檢驗提示差異具有統計學意義(120 nmol/Lvs. 對照組，P<0.01, 240 nmol/Lvs. 對照組,P<0.001，圖2B)。

24 h IC50為493 nmol/L，48 h IC50為426 nmol/L，96 h IC50 405 nmol/L

2.2 Avagacestat抑制破骨基因表達及骨吸收功能

檢測0、120、240 nmol/L 3組濃度Avagacestat對破骨細胞功能相關基因的影響，單因素方差分析提示3組不同劑量的Avagacestat影響破骨相關基因C-fos、Cath-K、TRAP表達量統計學差異顯著,Dunnett分析提示加藥組與對照組之間具有統計學差異，進一步，Turkey分析提示240 nmol/L組表達明顯低于120 nmol/L組，3種基因得出的P均小于0.05，差異具有統計學意義，提示Avagacestat濃度越高，對破骨細胞基因表達的抑制作用越明顯(圖3A)。

A:TRAP染色檢驗對照組、120 nmol/L、240 nmol/L 3組Avagacestat對破骨細胞形成的影響，TRAP陽性細胞至少有3個細胞核被認為是破骨細胞，紅色箭頭指示破骨細胞；B：偽足小體肌動蛋白條帶占比及破骨細胞數量的計數統計結果，**為P<0.01,***為P<0.001,****為P<0.000 1

此外，將破骨細胞接種于骨板之上，設置3組濃度的Avagacestat濃度培養基，4 d后觀察發現，加藥后骨板上骨溶解區域顯著減少，且藥物濃度越高，溶解破壞越少(圖3B)。

A：橫坐標為Avagacestat的濃度，縱坐標為破骨細胞相關基因的mRNA 相對表達量，120 nmol/L、240 nmol/L兩組濃度Avagacestat與對照組進行比較，**為P<0.01,***為P<0.001,****為P<0.000 1； B：BMMs接種于骨板，不同濃度的Avagacestat培養4 d后觀察溶骨情況

2.3 Avagacestat抑制LPS誘導的小鼠膝關節炎骨吸收

小鼠骨關節腔內注射LPS構建骨關節炎模型，分別注射PBS(假手術組)、注射LPS(LPS組)、注射LPS+Avagacestat(加藥組)，2周后取小鼠膝關節多聚甲醛固定后行高分辨率Micro-CT掃描，并進行骨重建，檢查發現加入LPS的骨關節炎模型中骨質破壞較假手術組嚴重，而加入Avagacestat的骨質密度較LPS誘導組損害減輕(圖3A)，對3組圖像進行骨分析提示，在加入LPS誘導關節炎后，骨密度(bone mineral density, BMD)、骨組織體積與組織體積比(BV/TV)、骨小梁數量(trabecular number, Tb.n)均出現減低，當同時加入Avagacestat，BMD、BV/TV、Tb.n均顯著提高，單因素方差分析提示3組數據有統計學差異，Turkey檢驗提示加藥組比LPS組數值顯著升高，差異具有統計學意義(圖4B)，進而表明Avagacestat可以抑制骨關節炎骨吸收。

A：膝關節三維骨重建圖，下層為骨含量分布圖，黃色箭頭指示骨質改變較為顯著的部位；B：BMD為骨密度、BV/TV為骨組織體積與組織體積比、Tb.n為骨小梁數量，均為體現骨質存留情況的指標，****為P<0.000 1

2.4 Avagacestat抑制骨關節炎模型中破骨細胞生成

取以上骨關節炎模型中3組小鼠的膝關節，固定包埋處理后(圖5C)，進行組織HE染色及TRAP標記實驗，實驗表明，LPS可以誘導膝關節炎癥反應，與假手術組相比，炎癥細胞浸潤顯著，而加藥組炎癥反應較LPS誘導組明顯減輕(圖5A)。TRAP實驗顯示LPS誘導的膝關節組織中破骨細胞數量大量增加，加入Avagacestat的膝關節炎模型中的破骨細胞數量相較LPS誘導組則顯著減少，Turkey檢驗P<0.05,提示兩組間差異具有統計學意義(圖5B，D)。

3 討 論

骨關節炎，作為一種慢性骨關節退行性變，骨穩態的破壞是其核心。在此過程中，破骨細胞的過度增殖和激活，對骨實質造成破壞，導致疾病的進展，因此，抑制破骨過程的過度激活成為一種潛在的治療思路。前期文獻調研提示破骨細胞表面的RANKL募集腫瘤壞死因子受體相關因子(tumor necrosis factor receptor-associated factors, TRAF)、核因子κB配體受體激活物(receptor activator for nuclear factor-κ，RANK)等[16-18]，激活C-fos，T-cell核因子c1(nuclear factor of activated T cells c1，NFAT)等一系列轉錄因子，參與破骨細胞的增殖分化和溶骨功能[19-22]，而NOTCH可通過NF-κB信號調節RANKL功能，進而影響破骨細胞分化和骨吸收過程[23]，NOTCH是調節細胞生命活動的信號受體，包括NOTCH1～4四種亞型，分為胞外結構域、跨膜結構域和胞內結構段(NOTCH intracellular domain, NICD)，其配體包括JAG1，JAG2，Delta1、3、4。在NOTCH與其配體結合后， γ-分泌酶可以水解

A:HE染色對比圖;B:TRAP標記實驗對比圖(破骨細胞染為紅色)，最下方兩圖為對應LPS組和加藥組的4倍放大圖;C:小鼠膝關節蠟塊標本；D:TRAP標記實驗中破骨細胞統計圖,****:P<0.000 1

NOTCH并釋放NICD，NICD向核內轉移，激活靶基因Hes1、Hey1等的表達，促使破骨細胞啟動溶骨[24]。因此，通過抑制γ-分泌酶，就可以抑制NOTCH水解，進而調控破骨細胞的骨溶解進程，所以，尋找合適的γ-分泌酶抑制劑是針對骨關節炎基本的潛在治療策略。

Avagacestat是一種γ-分泌酶抑制劑[13],而γ-分泌酶抑制劑可抑制IL-1β、TNF-α等多種因子表達[25]，其是否可以通過調節破骨細胞相關功能而改善關節炎中的溶骨性病變尚未被證實，因此設置本實驗探究其是否可以調節破骨細胞功能。在獲取小鼠的BMMs細胞誘導分化后，利用毒性實驗確定后續實驗選擇的藥物濃度，之后，TRAP實驗初步確定120 nmol/L與240 nmol/L藥物濃度培養中，破骨細胞顯著減少，且濃度越高，效果越明顯；而骨吸收實驗及破骨相關基因表達檢測證實此藥物對破骨細胞骨吸收功能具有抑制作用。

體內實驗部分，利用LPS關節內注射，構建骨關節炎模型[26]，Micro-CT影像學數據分析[27]和組織學檢查提示LPS誘導骨關節炎模型成骨，影像學和組織學都提示關節炎中骨質遭到破壞、炎癥細胞局部聚集、破骨細胞數量顯著增加，而Avagacestat加藥組，炎癥反應有效地被抑制、破骨細胞分布顯著減低、骨破壞也顯著減輕，印證了Avagacestat加藥后有效抑制破骨細胞的形成及功能，維持骨穩定。

綜上所述，Avagacestat通過影響破骨細胞的形成、調節骨吸收相關基因表達，抑制溶骨活動，因此，可作為延緩關節炎進展的潛在藥物。