凱里紅酸湯細菌群落多樣性分析及其優勢乳酸菌篩選

宮路路，李曉然，陳芳勇，王若曦，李潔*

(1.遵義醫藥高等專科學校 醫學技術系，貴州 遵義 563000；2.昆明理工大學 生命科學與技術學院，昆明 650500)

酸湯作為黔東南苗族、侗族的傳統發酵食品，在當地乃至貴州十分流行。酸湯種類很多，占主導地位的有紅酸湯和白酸湯。紅酸湯主要由野生毛辣角(野生西紅柿)、當地的辣椒以及糯米為主要原料發酵而成[1]。紅酸湯可以作為配料、調味品制作酸湯火鍋，有著獨特的色、香、味，能大大增進人們的食欲[2]。研究報道表明，酸湯具有開胃健脾、降脂減肥等作用[3]。凱里紅酸湯火鍋底料、內蒙古涮羊肉火鍋底料以及重慶火鍋底料被譽為中國三大特色火鍋底料。白酸湯主要由米湯或淘米水放在火塘邊自然發酵而成[4]。白酸湯可作為夏季的解暑飲料，清涼爽口，風味獨特；用白酸湯為主要調味料制作凱里酸湯魚，名揚中外[5]。當地有句俗語叫“三天不吃酸、走路打躥躥”[6]，可見人們對酸湯的喜愛。

目前凱里酸湯的研究主要集中在發酵工藝以及發酵動力學[7-9]、酸湯中分離微生物的抗氧化活性、營養成分分析、風味物質分析[10-11]、烹調方法對紅酸湯全反式番茄紅素含量的影響[12-14]、可培養微生物及其優勢微生物篩選[15]、酸湯對動物腸道微生物的影響[16-17]以及酸湯口服液的開發[18]等方面。近年來，高通量測序技術(Illumina MiSeq)發展迅猛，逐漸應用到酸湯微生物群落結構多樣性分析中[19-20]，極大地促進了人們對酸湯中微生物組成的了解。其結果可指導酸湯中優勢微生物分離，進行純菌種發酵研究。鄭莎莎等研究了干酪乳桿菌H1發酵紅酸湯，探索了該菌對紅酸湯品質以及特征代謝物的影響[21]。

本研究從凱里市采集到了3個酸湯樣品。通過高通量測序技術分析樣品中細菌群落種類多樣性。根據多樣性分析結果，有目的地篩選酸湯中優勢菌種，并對其進行分子生物學鑒定，為紅酸湯的進一步純菌種發酵研究奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品收集

從凱里市采集到3個酸湯樣品，分別命名為ST9、ST10和ST22。ST9和ST10樣品為從凱里市某農貿市場采集的傳統發酵紅酸湯；ST22為凱里市某知名品牌生產的紅酸湯。樣品采集后裝入50 mL離心管中進行收集，置于便攜式冰盒中，隨后立即運到實驗室，于4 ℃冰箱中保存。

1.2 實驗試劑

DNA提取裂解緩沖液：0.1 mol/L Tris-HCl，0.1 mol/L EDTA，0.75 mol/L 蔗糖；TE 緩沖液:10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)，1 mmol/L EDTA(pH 8.0)；Premix Ex TaqTM：大連Takara公司；DNA 純化回收試劑盒：QIAquick Gel Extraction Kit；MRS合成培養基：北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；瓊脂糖：生工生物工程(上海)股份有限公司；甘油：天津試劑三廠。

1.3 實驗儀器

超凈工作臺 蘇凈集團安泰公司；ZB-1090制冰機、普通冰箱 中科美菱低溫科技股份有限公司；ABI 7200 PCR儀 美國ABI公司；水平電泳儀 Bio-Rad公司；微量移液器 德國Eppendorf公司；制膠板 北京六一儀器廠；凝膠成像系統 德國Syngen公司；羅氏GS-FLX測序儀 瑞士Roche公司；3-18K離心機 美國Sigma公司；Labnet 230V EU渦旋儀 美國Labnet公司；高壓滅菌鍋 日本TOMY公司。

1.4 數據庫及分析軟件

Silva(Release 132，http://www.arb-silva.de)；mothur(version 1.41.1, http://www.mothur.org/)。

1.5 實驗方法

1.5.1 DNA提取

改良Schmidt等的方法，進行樣品DNA提取[22-23]。提取的DNA采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測提取質量，將提取質量合格的DNA樣品保存，不合格樣品重新提取DNA，以得到合格的DNA樣品。

1.5.2 細菌16S rDNA區域目的基因擴增

使用細菌16S rDNA通用引物，擴增細菌V3～V4區域。引物序列：338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)；806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。

以提取的細菌基因組DNA為模板，進行目的基因PCR擴增，擴增體系：Premix Ex TaqTM聚合酶10 μL，模板基因組DNA， 0.5 μL，目的基因上下游引物各1 μL，ddH2O 8 μL。PCR擴增程序：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸15 s，30個循環，72 ℃延伸5 min。

吸取上述PCR擴增產物5 μL，用去離子水稀釋10倍，再按照原反應條件擴增5個循環，減少PCR產物非特異性擴增[24]，經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，-20 ℃保存PCR產物備用。

1.5.3 測序結果分類鑒定

根據barcode將測序序列分配到對應的樣品中，去除barcode以及引物序列得到有效序列。使用mothur v1.43.1軟件包MiSeq SOP進行序列拼接，去除質量欠佳的序列，保留長度大于400 bp的序列。運用mothur v1.43.1軟件classify.seqs命令分析，結合Silva的SSU rRNA序列數據庫V138分類信息[25]得到序列分類數據。

1.5.4 α多樣性指數分析

使用mothur中classify.seqs命令獲得樣品中微生物的群落結構，rarefaction.single命令得到微生物Chao1、Refaction和ACE等指數。以同源性為97%劃分可操作分類單元(operational taxonomic unit,OTU)。根據以上處理計算樣品ACE、Chao1、Shannon以及覆蓋度，繪制Rarefaction曲線。

1.5.5 酸湯中微生物分離與保存

MRS培養基是分離乳酸菌的選擇性培養基。結合上述樣品多樣性分析，在屬水平上，酸湯中的優勢微生物為乳桿菌屬。亦有研究發現紅酸湯中主要發酵菌群為乳酸菌[26]。類比肖甜甜等參考高通量分析進行白酸湯中優勢微生物篩選，本研究采用MRS選擇性培養基有目的地分離傳統發酵紅酸湯中優勢乳酸菌。

取1 mL酸湯液體，經無菌生理鹽水進行梯度稀釋，吸取20 μL稀釋倍數為10-6的稀釋液涂布于MRS瓊脂平板，35 ℃靜置培養24 h。挑取具有不同形狀、大小的單菌落，在MRS瓊脂平板上進行劃線，35 ℃靜置培養24 h。挑取不同生長形態的單菌落至5 mL MRS液體試管中進行培養。結束后，加入30% 甘油置于-80 ℃保存。

1.5.6 酸湯中細菌基因組DNA提取

將1.5.5中保存的菌株進行解凍，利用微量移液器吸取20 μL菌液，接種到含有5 mL MRS液體培養基的試管中，置于30 ℃恒溫培養箱中培養24 h。培養出的菌液采用改良CTAB法提取該菌株基因組DNA，經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，保存合格的DNA備用。

1.5.7 酸湯中細菌分子生物學鑒定

以上述提取的基因組DNA為模板，加入細菌16S rRNA通用引物F27(5′-AGAGTATGATCATGGCTCAG-3′)，R1492(5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′)擴增靶基因[27]。擴增體系為：Ex Taq 25.0 μL，F27和R1492引物各1.0 μL，DNA 模板 2.0 μL，ddH2O 21.0 μL。按照程序95 ℃熱變性 30 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min 30 s，35個擴增循環，結束后72 ℃延伸10 min，以便得到足夠數量的目的DNA分子。

對PCR產物進行鑒定、純化，采用雙脫氧鏈終止法進行序列測定。所得測序核苷酸序列提交NCBI數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)，用BLAST軟件與GeneBank中已知的16S rDNA核苷酸序列進行同源性比較，當被檢菌株的核苷酸序列與參考菌株的同源性大于97%時，即確定為同一個菌種[28]。

2 結果與分析

2.1 樣品序列信息和多樣性指數

樣品進行高通量測序后得到3個樣品的細菌群落，見表1。按照同源性≥97%劃分OTUs，3個樣品的細菌群落共得到276個OTUs。比照16S rRNA的Silva數據庫，將所有細菌群落分為12個細菌門，69個屬。從ACE指數來看，細菌群落豐度ST10>ST9> ST22；從Shannon指數可以看出，ST22酸湯樣品的多樣性高于傳統發酵的酸湯ST9和ST10。ST22為工業化生產的酸湯產品，推測與其發酵工藝復雜性有關。從Chao1指數可以看出，ST10的值最大，說明其群落結構豐度最高。從覆蓋度可以看出，3個樣品的覆蓋度都比較高。

表1 基于序列相似度為97%的細菌豐度

根據Rarefaction文件繪制Rarefaction稀釋曲線，見圖1。

圖1 序列相似度為97%的細菌Rarefaction評估

由圖1可看出大部分曲線尚未達到平臺期，處于一直上升的狀態，說明測序得到的樣品序列不能全部反映其微生物群落的多樣性。然而從覆蓋率數據分析，所有樣品都在90%以上，最低為92%，最高達到了95%，顯示樣品中的主要優勢微生物種類基本得到了呈現。

2.2 細菌群落多樣性分析

將3個樣品序列與Silva SSU rRNA 數據比對，發現其細菌群落具有一定差異性。由圖2可知，ST9中檢測到5個門，分別為Firmicutes， Proteobacteria，Actinobacteriota， Bacteroidota， Patescibacteria。其中厚壁菌門(Firmicutes)為優勢菌門，其序列數占總序列數的86.16%，其次是變形菌門(Proteobacteria)，占比13.32%，其余門的占比低于0.4%。ST10中檢測到9個門，分別為Firmicutes，Proteobacteria，Actinobacteriota，Bacteroidota，Bacteria_unclassified，Bdellovibrionota，Campilobacterota，Patescibacteria，Deinococcota。其中厚壁菌門(Firmicutes)為優勢菌門，其序列數占總序列數的92.81%，占有絕對優勢；其次是變形菌門(Proteobacteria)，占比5.71%，其余門的占比低于0.6%。ST22中檢測到4個門，分別為Proteobacteria，Firmicutes，Bacteroidota， Actinobacteriota。其中厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)為優勢菌門，其序列數分別占總序列數的54.81%和39.77%，其他兩個分別為Bacteroidota占比4.55%，Actinobacteriota占比0.87%。對比上述結果，3個樣品菌群結構存在著很大差異，但基本優勢菌門為厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)，與王琪琪等研究的紅酸湯中優勢菌門基本一致。

圖2 酸湯樣品中細菌在門的分類水平分布

由圖3可知，在屬的分類水平上，ST9酸湯樣品中有44個屬，乳酸桿菌屬(Lactobacillus)豐度最高，達42%，其他屬所占比例小于3.00%(最大為2.04%)。ST10酸湯樣品中有44個屬，乳酸桿菌屬(Lactobacillus)豐度最高(83.50%)；其次為假單胞菌屬(Catenococcus，7.74%)，其他屬所占比例小于2.00%(最大為1.27%)。ST22酸湯樣品中有45個屬，各個屬占比較均勻。假單胞菌屬(Catenococcus)占比最高(16.27%)，其次為芽孢桿菌屬(Bacillus，16.73%)，Aeribacillus占比5.50%，Staphylococcus占比4.95%，Proteus占比4.80%，Halomonas占比4.74%，Lactobacillus占比4.51%，Stenotrophomonas占比3.57%，Lelliottia占比2.40%。可見，屬的總數相差不大，但相應各屬所占比例各不相同。ST9和ST10優勢比較明顯的屬為乳酸桿菌屬(Lactobacillus)，ST22優勢菌屬為假單胞菌屬(Catenococcus)和芽孢桿菌屬(Bacillus)，其他屬占比較少。

圖3 酸湯樣品中細菌在屬的分類水平分布

2.3 MRS平板涂布培養結果

將酸湯樣品ST9、ST10和ST22進行一定稀釋，然后在超凈工作臺中涂布MRS瓊脂平板，在恒溫培養箱中培養(部分結果見圖4中a和b)。

圖4 MRS瓊脂培養基細菌培養

由圖4可知，MRS瓊脂培養基上長出了乳白色菌落，各菌落形狀差異不大，生長態勢良好。

2.4 平板劃線分離結果

從平板MRS瓊脂培養基上挑取單菌落，然后進行MRS瓊脂平板劃線分離菌株。部分菌株的劃線分離結果見圖5。

圖5 細菌平板劃線分離

由圖5可知，部分菌落離散性不是很好，應進一步劃線分離。

2.5 菌種鑒定結果

結合純培養技術，從樣品ST9中分離得到12株細菌，分別為2株植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、1株Weissellaminorgene、9株枯草桿菌(Bacillussp.)。從樣品ST10中分離得到14株菌，分別為11株植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、1株溶血性葡萄球菌(Staphylococcushaemolyticus)、1株戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus)、1株肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)；從樣品ST22中分離得到3株菌，分別為2株貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)、1株芽孢桿菌(Bacillussp.)，見表2。

表2 菌種鑒定結果

3 結論

從高通量測序分析到乳酸菌分離鑒定來看，傳統發酵酸湯中細菌種類多樣性低于工業化生產的酸湯產品。高通量測序分析顯示酸湯中優勢菌為乳桿菌和芽孢桿菌，與純培養分離的結果基本一致。工業化生產的酸湯細菌多樣性豐富，可造就酸湯豐富多樣的口味。多樣化的細菌種類對酸湯的風味影響很大，使工業化酸湯占有很大優勢。

從可培養技術來看，酸湯樣品中分離得到的細菌多為乳酸菌和芽孢桿菌。在酸湯發酵后期，乳酸菌是酸湯發酵的主要微生物[29]。呈現出生長繁殖加快，可形成酸性低pH發酵環境；同時乳酸菌在生長過程中可產生一些抑菌物質，抑制其他腐敗菌生長，并能夠對酸湯風味形成起到重要作用[30]。同時在3個樣品中也分離到了一些芽孢桿菌。研究報道表明，芽孢桿菌在食品發酵中起著重要的作用。芽孢桿菌具有豐富的酶類系統[31]，為生產豐富多樣的酸湯風味奠定了基礎，可生產出具有理想感官特性的發酵食品[32]，是一類具有潛力的益生菌[33]。自然發酵的酸湯品質受家庭作坊生產習慣的影響較大，一定程度上影響酸湯產品風味，造成品質不均的現象。采用微生物純培養技術，從傳統發酵中篩選優勢乳酸菌作為發酵劑，是未來酸湯生產的一個方向。大自然中微生物資源豐富，從傳統發酵酸湯中尋找微生物資源，得到適合酸湯發酵生產的發酵劑，生產出品質穩定、具有獨特風味的酸湯，可以很好地促進凱里酸湯名片的打造，對于推廣凱里酸湯起到促進作用。