酸法提取紫茄皮花青素及其性質(zhì)研究

王釗，岳曉禹，溫雙雙，李玉江，張本尚，鄒建*

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，鄭州 450046；2.河南省科學(xué)院高新技術(shù)研究中心，鄭州 450002；3.河南省科學(xué)院，同位素研究所有限責(zé)任公司，鄭州 450015)

茄子是我國(guó)重要而種類豐富的蔬菜之一，富含蛋白質(zhì)、脂肪、維生素、礦物質(zhì)等多種營(yíng)養(yǎng)功能成分[1]，其中紫茄子是較為常見(jiàn)的一種茄子，因其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高、風(fēng)味醇美而受到人們的喜愛(ài)[2]。研究表明，紫茄皮中含有豐富的花青素[3]，具有抗氧化、抗突變、抗癌、預(yù)防心腦血管疾病、保護(hù)肝臟、抑制腫瘤細(xì)胞發(fā)生等多種生理功能[4-6]，對(duì)由氧化自由基引發(fā)的慢性退行性疾病具有輔助治療作用[7-9]。作為植物中的水溶性天然成分[10]，花青素除具有保健功能外，還可作為天然食用色素，提升食品、化妝品等的安全性[11-12]。

近年來(lái)，隨著人們對(duì)花青素功能的認(rèn)識(shí)愈發(fā)深入，對(duì)于各類天然植物中花青素的研究已成為天然產(chǎn)物研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)[13-15]；然而，關(guān)于紫茄皮花青素的研究還相對(duì)較少[16-17]。當(dāng)前，人們通常只食用茄子果肉，而對(duì)富含花青素的紫茄皮則往往棄之不用，這造成了資源的極大浪費(fèi)。鑒于此，本文擬通過(guò)溶劑浸提法提取紫茄皮花青素，優(yōu)化其提取工藝，并對(duì)紫茄皮花青素的穩(wěn)定性與抗氧化能力進(jìn)行研究。期望通過(guò)本研究進(jìn)一步提升紫茄子深加工技術(shù)水平，為實(shí)現(xiàn)紫茄皮資源的綜合利用、提升其產(chǎn)品附加值提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本試驗(yàn)使用的紫茄子購(gòu)于鄭州丹尼斯超市長(zhǎng)江路店。

冰乙酸、水楊酸、氫氧化鈉、乙醇、L(+)-抗壞血酸(均為分析純)：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；硫酸亞鐵(分析純)：鄭州派尼化學(xué)試劑廠；過(guò)氧化氫(分析純)：天津市鼎盛鑫化工有限公司；2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基(分析純)：上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DZF-6050真空干燥箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；ML-800Y高速多功能粉碎機(jī) 武義海納電器有限公司；TU-1901紫外雙光束可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;FA3204B電子分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;HWCL-3集熱式恒溫磁力攪拌器 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 原料的預(yù)處理和操作步驟

選取色澤鮮亮的紫茄子，將紫茄皮剝離并放入真空干燥箱中，于55 ℃條件下低溫真空烘干至恒重，放入粉碎機(jī)中粉碎并過(guò)40目篩，將所得紫茄皮干物質(zhì)置于干燥器內(nèi)密閉避光保存。通過(guò)溶劑浸提法，分別考察溶劑濃度、料液比、提取溫度、提取時(shí)間4個(gè)單因素對(duì)紫茄皮花青素提取效果的影響。在單因素優(yōu)化的基礎(chǔ)上通過(guò)正交試驗(yàn)法進(jìn)一步優(yōu)化提取工藝，并通過(guò)3次重復(fù)試驗(yàn)對(duì)最優(yōu)條件進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3.2 單因素試驗(yàn)條件設(shè)計(jì)

以冰乙酸為提取溶液，分別考察溶液濃度、料液比、提取溫度、提取時(shí)間等單因素條件：每次準(zhǔn)確稱取0.5 g紫茄皮粉，分別設(shè)置乙酸濃度(20%、40%、60%、80%、100%)、料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，g/mL)、提取溫度(50，55，60，65，70 ℃)、提取時(shí)間(30，40，50，60，70 min)4個(gè)單因素中的3個(gè)因素固定不變，探索單一因素變化對(duì)紫茄皮花青素提取效果的影響，在此基礎(chǔ)上分別對(duì)4個(gè)單因素條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

通過(guò)對(duì)單因素試驗(yàn)結(jié)果的分析，分別選取乙酸濃度、料液比、提取溫度、提取時(shí)間4個(gè)因素的較優(yōu)水平，采用L9(34)正交試驗(yàn)表設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，對(duì)提取紫茄皮花青素的工藝參數(shù)進(jìn)一步優(yōu)化，并通過(guò)分析確定最佳組合參數(shù)。

1.3.4 最佳工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

在正交試驗(yàn)最佳提取工藝條件下重復(fù)提取3次，對(duì)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3.5 紫茄皮中花青素含量測(cè)定方法

準(zhǔn)確稱取0.5 g紫茄皮粉，按照最優(yōu)提取工藝提取紫茄皮花青素，準(zhǔn)確量取提取液2.5 mL，定容至25 mL，測(cè)定其在535 nm波長(zhǎng)下的吸光度值，按公式(1)計(jì)算紫茄皮粉中花青素含量[18]：

(1)

式中：V為花青素溶液定容體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；98.2為花青素在535 nm處的平均消光系數(shù)；M為紫茄皮粉質(zhì)量，g。

1.3.6 金屬離子對(duì)紫茄皮花青素穩(wěn)定性的影響

參照文獻(xiàn)[19]的方法，考察分別加入了Fe2+、Mg2+、Zn2+、Na+、K+的花青素溶液在室溫條件下各自靜置1 h(A1)和6 h(A6)后，吸光度值的變化。

1.3.7 酸度對(duì)紫茄皮花青素穩(wěn)定性的影響

參考文獻(xiàn)[20]的方法，分別配制pH值為3～12的花青素溶液，考察溶液pH值變化對(duì)花青素穩(wěn)定性和吸光度的影響。

1.3.8 紫茄皮花青素對(duì)羥基自由基的清除率

參考文獻(xiàn)[21-22]的方法，按照公式(2)計(jì)算不同濃度的花青素溶液和L(+)-抗壞血酸對(duì)羥基自由基的清除率：

(2)

式中：AX為試驗(yàn)組吸光度值，AY為對(duì)照組吸光度值，AZ為空白組吸光度值。

1.3.9 紫茄皮花青素對(duì)DPPH自由基的清除率

參考文獻(xiàn)[23]的方法，按照公式(3)計(jì)算不同濃度的花青素溶液對(duì)DPPH自由基的清除率：

清除率(%)=(1-試驗(yàn)組吸光度/空白組吸光度)×100%。

(3)

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 冰乙酸濃度對(duì)紫茄皮花青素提取效果的影響

由圖1可知，當(dāng)冰乙酸溶液的濃度為20%時(shí)，提取效果最佳，當(dāng)冰乙酸溶液的濃度提升至40%時(shí)，提取液的吸光度值急劇減小，此后隨著冰乙酸溶液濃度的不斷增大，提取液的吸光度值隨之緩慢減小。為確認(rèn)冰乙酸溶液濃度的準(zhǔn)確性，以20%的冰乙酸為中心，對(duì)其兩側(cè)的冰乙酸溶液濃度(10%和30%)進(jìn)行篩選，重復(fù)以上操作。雖然與其他濃度相比提取效果更好，但是10%和30%的冰乙酸溶液的提取效果依然明顯差于20%的冰乙酸溶液。因此，可以認(rèn)為提取紫茄皮花青素的最佳冰乙酸溶液濃度為20%。究其原因，可能是當(dāng)冰乙酸濃度過(guò)低時(shí)，溶液極性偏低，導(dǎo)致提取不充分；冰乙酸濃度過(guò)高可能導(dǎo)致其他雜質(zhì)析出，從而影響了提取效果。

圖1 冰乙酸濃度對(duì)提取效果的影響

2.1.2 料液比對(duì)紫茄皮花青素提取效果的影響

由圖2可知，當(dāng)料液比為1∶10～1∶30時(shí)，隨著料液比的增大，提取液的吸光度值也隨之增大，當(dāng)料液比為1∶30時(shí)，吸光度值達(dá)到最大，此時(shí)提取效果最佳。然后，隨著料液比的增加，其吸光度值持續(xù)減小。究其原因，可能是隨著料液比的增加，紫茄皮中的一些雜質(zhì)也隨之析出，對(duì)提取過(guò)程產(chǎn)生了干擾，影響了提取效果。因此，提取紫茄皮花青素的最佳料液比為1∶30。

圖2 不同料液比對(duì)提取效果的影響

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)紫茄皮花青素提取效果的影響

由圖3可知，當(dāng)提取時(shí)間為30～60 min時(shí)，提取液的吸光度值隨著提取時(shí)間的增加而增大，在60 min時(shí)提取效果最佳；當(dāng)提取時(shí)間延長(zhǎng)至70 min時(shí)，吸光度值有所下降，表明單純延長(zhǎng)提取時(shí)間并不會(huì)使提取效果提高，即紫茄皮花青素的提取效果并非與提取時(shí)間成正比。因此，提取紫茄皮花青素的最佳提取時(shí)間為60 min。

圖3 不同提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響

2.1.4 提取溫度對(duì)紫茄皮花青素提取效果的影響

由圖4可知，當(dāng)提取溫度為50～60 ℃時(shí)，提取液的吸光度值隨著提取溫度的上升而增大，在提取溫度為60 ℃時(shí)，吸光度值達(dá)到最大；但當(dāng)提取溫度升高至70 ℃時(shí)其吸光度值大幅下降。產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因可能是：當(dāng)溫度過(guò)高時(shí)，紫茄皮花青素內(nèi)部結(jié)構(gòu)被破壞，影響了紫茄皮花青素的提取效果。因此，提取紫茄皮花青素的最佳提取溫度為60 ℃。

圖4 不同提取溫度對(duì)提取效果的影響

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)對(duì)單因素試驗(yàn)結(jié)果的分析，對(duì)冰乙酸濃度、料液比、提取時(shí)間、提取溫度進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)，從中篩選出最優(yōu)提取方案。正交試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 L9(34)正交試驗(yàn)因素水平表

表2 正交試驗(yàn)方案及結(jié)果

續(xù) 表

由表2中極差R值可知，雖然提取紫茄皮花青素的4個(gè)單因素條件均對(duì)提取得率產(chǎn)生影響，但不同因素的影響力不同。通過(guò)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果分析可知，各因素對(duì)紫茄皮花青素提取得率的影響順序?yàn)椋築(料液比)>C(提取時(shí)間)>A(溶劑濃度)>D(提取溫度)，其中料液比是主要的影響因素，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響最顯著。通過(guò)正交試驗(yàn)預(yù)測(cè)到的最優(yōu)方案為A2B2C2D2，即提取溶劑濃度20%、料液比1∶30、提取溫度60 ℃、提取時(shí)間60 min。

由于正交試驗(yàn)所預(yù)測(cè)得到的最優(yōu)方案并未出現(xiàn)在正交試驗(yàn)表中，需要對(duì)此參數(shù)組合下的紫茄皮花青素提取率進(jìn)行驗(yàn)證，以確保試驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)性。因此，在該提取工藝條件下通過(guò)3組平行試驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證(結(jié)果取平均值)，見(jiàn)表3。

表3 重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果具有代表性，表明該提取工藝條件合理可行，具有良好的重現(xiàn)性。在此最優(yōu)工藝條件下，通過(guò)公式(1)計(jì)算得出花青素的含量為1.528 mg/g。

2.3 紫茄皮花青素穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.3.1 金屬離子對(duì)茄子皮花青素穩(wěn)定性的影響

由表4可知，F(xiàn)e2+對(duì)紫茄皮花青素穩(wěn)定性的影響較大，而Mg2+、Zn2+、Na+、K+對(duì)紫茄皮花青素穩(wěn)定性的影響相對(duì)較小，表明不宜用鐵制品加工和盛裝紫茄皮花青素溶液。

表4 金屬離子對(duì)紫茄皮花青素穩(wěn)定性的影響

2.3.2 pH值對(duì)茄子皮花青素穩(wěn)定性的影響

由圖5可知，當(dāng)pH值為2～7時(shí)，隨著pH值的不斷增大，溶液的酸度越來(lái)越小，紫茄皮花青素的吸光度也在緩慢減小，此時(shí)試管內(nèi)的溶液呈現(xiàn)紅色；當(dāng)pH>7時(shí)，隨著堿性越來(lái)越大，紫茄皮花青素的吸光度不斷減小，且吸光度值的減小速度遠(yuǎn)比酸性條件時(shí)快，試管內(nèi)的溶液轉(zhuǎn)為無(wú)色。說(shuō)明紫茄皮花青素穩(wěn)定性受pH值的影響較大，適宜在酸性條件下保存和使用。

圖5 不同pH值對(duì)紫茄皮花青素穩(wěn)定性的影響

2.4 紫茄皮花青素的抗氧化試驗(yàn)

2.4.1 紫茄皮花青素對(duì)羥基自由基的抗氧化活性研究

由圖6可知，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，紫茄皮花青素和Vc對(duì)羥基自由基的清除率均隨著質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，但Vc對(duì)羥基自由基的清除率強(qiáng)于紫茄皮花青素。由此可見(jiàn)，紫茄皮花青素對(duì)羥基自由基有一定的清除能力，但清除能力弱于Vc。

圖6 紫茄皮花青素對(duì)羥基自由基的清除率

2.4.2 紫茄皮花青素對(duì)DPPH自由基的抗氧化活性研究

由圖7可知，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，隨著紫茄皮花青素和Vc濃度的增加，對(duì)DPPH自由基的清除率都逐漸增強(qiáng)，具有很好的量效關(guān)系，表明兩者都具有良好的清除DPPH自由基的能力。

圖7 不同質(zhì)量濃度紫茄皮花青素對(duì)DPPH自由基的清除率的影響

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用冰乙酸溶液提取紫茄皮中的花青素，以花青素提取得率為指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)探索了提取紫茄皮花青素的最佳工藝條件。結(jié)果表明，冰乙酸溶液對(duì)紫茄皮花青素顯示出了良好的提取得率，各單因素最佳條件分別為：冰乙酸濃度20%，料液比1∶30，提取溫度60 ℃，提取時(shí)間60 min；而正交試驗(yàn)的最佳提取工藝條件為：冰乙酸濃度20%，料液比1∶30，提取溫度60 ℃，提取時(shí)間60 min。通過(guò)3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，所得吸光度值重現(xiàn)性良好，表明該工藝條件在提取紫茄皮花青素時(shí)效果顯著，可為紫茄皮花青素的提取提供一定的理論依據(jù)。本試驗(yàn)還研究了紫茄皮花青素的穩(wěn)定性和抗氧化活性，結(jié)果表明，與其他金屬離子相比，F(xiàn)e2+金屬離子對(duì)紫茄皮花青素穩(wěn)定性的影響較明顯，因此不宜使用鐵制品加工和盛裝紫茄皮花青素溶液；此外，紫茄皮花青素的穩(wěn)定性受pH值的影響較大，試驗(yàn)表明紫茄皮花青素適宜在酸性條件下保存和使用。與此同時(shí)，抗氧化活性試驗(yàn)結(jié)果表明，紫茄皮花青素對(duì)羥基自由基和DPPH自由基都有著良好的清除能力。