無瓣海桑來源內生真菌Aspergillus sp.HNY16-5B中的二聚呫噸類化合物*

劉亞月，吳穎楠，佘志剛

1. 廣東海洋大學食品科技學院，廣東 湛江 524088

2. 中山大學化學學院，廣東 廣州 510006

曲霉Aspergillus按生物分類學分類歸入半知菌亞門Deuteromcotina、絲狀菌綱Hyphomycetes、絲孢目Hyphomycetales、從梗孢科Moniliaceae，擁有不少于170 種亞種，是一類重要的微生物菌種資源［1-2］。目前常見的曲霉有棒曲霉Aspergillus clavatus、灰綠曲霉Aspergillus gluucus、黃褐曲霉Aspergillus cervinnus、煙曲霉Aspergillus fumigatus、費氏曲霉Aspergillus fisheru、黑曲霉Aspergillus niger、白曲霉Aspergillus candidus、黃曲霉Aspergillus flavus、文氏曲霉Aspergillus wentii、土曲霉Aspergillus terreus等［3］。

作為目前最大、最廣泛被研究的真菌菌屬之一，曲霉為大量結構新穎的活性代謝產物的產生提供了無限可能［4-11］。中科院王斌貴課題組［6］從深海冷泉真菌Aspergillus insuetusSD-512 中分離獲得3 個新的蛇孢菌素二倍半萜和3 個新的法尼基化苯酞衍生物。活性測試表明化合物顯示廣泛的抑菌活性。澳大利亞學者Capon 等［7］從Aspergillussp. CMB-MRF324 中分離獲得6 個新的單萜millmerranones A-F，乙酰膽堿酯酶抑制活性顯示，6 個化合物均顯示較強的抑制活性（IC50<3.8 μmol/L）。中山大學佘志剛課題組［8］從采集自海南東寨港紅樹林自然保護區的紅樹植物海桑內生真菌Aspergillussp. 中獲得了1 個新骨架的二倍半萜化合物asperterpenoid A。活性研究表明，該化合物顯示強的mPTPB抑制活性（IC50=2.2 μmol/L）。同年，該課題組肖澤恩博士［9］對廣西山口國家紅樹林保護區紅樹植物老鼠簕Acanthus ilicifolius的根部中分離得到1 株內生真菌Aspergillussp. 進行分離研究，得到2個含有5/8/6/6四環新骨架的二倍半萜類化合物asperterpenols A 和B。乙酰膽堿酯酶抑制活性研究表明，兩者均對乙酰膽堿酯酶顯示強的抑制活性（IC50值分別為2.3 和3.0 μmol/L）。德國學者［10］從地中海Limski 運河的海綿真菌中分離得到7 個新的生物堿化合物，其中包括tryptoquivaline K 和6 個含有罕見的1-氨基環丙烷-1-羧酸殘基片段的fumiquinazolines K-P，該真菌經鑒定也屬于Aspergillussp.。因此，開展曲霉屬真菌次級代謝產物的研究具有廣泛的研究前景。

本論文對分離自海南東寨港紅樹林自然保護區的紅樹植物無瓣海桑Sonneratia apetala的內生真菌Aspergillussp. HNY16-5B 進行了發酵培養，并對其次級代謝產物進行了分離純化和結構鑒定工作，從中獲得了5個二聚呫噸化合物類化合物。經核磁解析和與文獻數據比對，確定了化合物的結構，依次為asperpyrone B（1），fonsecinone A（2），aurasperone A（3），asperpyrone A（4）和dianhydroaurasperone C（5）（圖1）。本論文首次通過Cu Kα的X-Ray單晶衍射，確定了化合物2的軸手性為S。并通過對比CD 譜，可確定其他的化合物的軸手性均為S。

圖1 化合物1～5的結構Fig.1 The structure of compounds 1-5

1 儀器與材料

AVANCE Ⅲ400 和500 MHz 核磁共振波譜儀（Bruker BioSpin，瑞士）；Chirascan ?CD 光譜儀（Applied Photophysics，英國）；DSQ EI-MS 質譜儀（Thermo Fisher，美國）；Agilent X 射線單晶衍射（Agilent，美國），銅靶；HPLC：Agilent HP 1100高效液相色譜儀（Agilent，美國），Ultimate?XB-C18（5 μm，10 mm×250 mm）色譜柱。薄層層析GF254硅膠板（青島煙臺，中國）；200-300 目柱層層析硅膠（青島海洋化工廠，中國）；Sephadex LH-20（GE Healthcare，英國）；ODS 色譜填料（YMC，日本）；常規試劑均為分析純。

菌株HNY16-5B采集于中國海南東寨港紅樹林自然保護區，由紅樹植物無瓣海桑Sonneratia apetala的樹葉中分離得到。通過用真菌ITS 引物ITS1 和ITS4 擴增真菌DNA 序列［12］，所得的堿基序列在GenBank 中用BLAST 進行進化樹相似性分析，鑒定為曲霉屬真菌Aspergillussp.。該菌種的DNA 序列已提交至GenBank（序號KP059102），該菌株目前保藏在中國典型培養物保藏中心。

2 提取與分離

菌株HNY16-5B 在25 ℃下用察氏培養基發酵，培養基配方為：硝酸鈉3 g，磷酸氫二鉀1 g，硫酸鎂0.5 g，氯化鉀1 g，硫酸亞鐵0.01 g，蔗糖20 g，瓊脂20 g，1 L水。經121 ℃滅菌25 min、冷卻后，接入種子液5 mL，靜置培養的時間為28～30 d。

發酵物用等體積的二氯甲烷/甲醇提取3 次，獲得有機相；有機相通過減壓濃縮后；再用乙酸乙酯萃取3 次，濃縮得到6.9 g 粗浸膏。所得粗浸膏通過柱層析（硅膠：200～300 目）進行初步分離，以石油醚-乙酸乙酯（體積比為90∶10，70∶30，60∶40，50∶50，40∶60，25∶75，100∶0）為流動體系進行梯度洗脫，收集得到7 個組分（Fr. 1～Fr. 7）。各組分經TLC 檢測后，對Fr.5（836 mg）進行正相硅膠柱層析，用氯仿-甲醇（體積比為50∶1，20∶1，10∶1，5∶1，1∶1）梯度洗脫，收集獲得12個組分（Fr.5-1～Fr.5-12）。組分Fr.5-7 常溫下靜置揮發獲得固體不溶物，分別用石油醚、二氯甲烷和甲醇洗滌3 次，獲得化合物1（7.5 mg）。對組分Fr.5-7采用甲醇進行重結晶，晶體分別用石油醚和甲醇洗滌3 次，獲得化合物2（15.5 mg）。將Fr. 4（128 mg）通過半制備HPLC進行分析，流動相為甲醇-水，體積比為65∶35 等度洗脫，流速為2 mL/min，相應獲得化合物3（tR=27.5 min，5.5 mg）和4（tR= 31.0 min，3.8 mg）；將Fr. 6（228 mg）多次使用葡聚糖凝膠Sephadex LH-20［氯仿-甲醇（體積比1∶1）；純甲醇體系］，收集獲得8 個組分（Fr.6-1～Fr.6-8）。組分Fr.6-4常溫下靜置揮發獲得固體不溶物，分別用石油醚、二氯甲烷和甲醇洗滌3次，得到化合物5（10.9 mg）。

3 α-葡萄糖苷酶抑制活性測試

采用比色法［13］測定化合物對α-葡萄糖苷酶的抑制活性。結果顯示化合物1～5對α-葡萄糖苷酶均沒有明顯的抑制活性（IC50>200 μmol/L）。

4 結果與分析

4.1 菌株鑒定

菌株HNY16-5B 經rDNA 的ITS 序列測定，測序結果如下：

將菌株HNY16-5B 與NCBI 數據庫進行比對后，選擇數據庫中序列相似性較高的已有序列進行BLAST，并使用MEGA7.0 構建進化樹（圖2）。進化樹結果表明HNY16-5B屬于Aspergillussp.。

圖2 HNY16-5B的進化樹Fig.2 The evolutionary tree of HNY16-5B

4.2 結構鑒定

化合物1，黃色粉末，［α］+2.8（c0.01 CHCl3），EI-MS 給出分子離子峰為m/z556［M］+，結合1H 和13C NMR 推斷該化合物的分子式為C31H24O10，不飽和度Ω=20，說明分子中存在大量不飽和體系。1H NMR 譜圖給出了2 個螯合羥基質子信號δH13.42 和δH12.68；一組間位耦合質子信號δH6.47（d，J=2.2 Hz）和6.25（d，J=2.2 Hz）；4 個孤立的芳香質子信號δH7.13，δH6.96，δH6.31，δH6.29；3 個 甲 氧 基 質 子 信 號δH4.00，δH3.63，δH3.61；以及2 個甲基質子信號δH2.54 和δH2.46。13C NMR譜圖中顯示有31個碳信號：包括2個酮羰基 碳δC183.0 和δC182.8；3 個 甲 氧 基δC61.7，δC56.2，δC55.5；2 個甲基碳δC20.7 和δC20.7；以及24 個成對出現的sp2雜化碳，結合氫譜中給出的2 個特征性螯合羥基質子信號，說明該化合物可能是1個角型萘并吡喃-γ-酮的二聚體。HMBC譜圖中（圖3），由H-9′和C-7′，C-8′，C-10′，C-14′有相關；H-7′和C-6′，C-8′，C-9′，C-14′有相關；H-3′和C-2′，C-4′，C-12′有相關，可推斷其中1 個單元的骨架為2，5，6，8，10-五取代萘并角型吡喃-γ-酮。進一步分析HMBC 譜圖可知，2 個甲氧基質子δH4.00 和δH3.63 分別和C-8′和C-10′相關，表明這2 個甲氧基分別連在8′位和10′位的碳上。通過同樣的方法確定另1 個單元的骨架也為2，5，8，9，10-五取代角型萘并吡喃-γ-酮的二聚體。經文獻檢索發現，該化合物的核磁數據（表1）與已知化合物asperpyrone B的核磁數據一致［14］，故鑒定化合物1為已知化合物asperpyrone B。

圖3 化合物1的HMBC相關示意圖Fig.3 The HMBC correlations of compound 1

化合物2，黃色粉末，［α］+ 12.4（c0.01 CHCl3），EI 質譜顯示分子離子峰為m/z為570［M］+。結合1H 和13C NMR 推斷該化合物的分子式為C32H26O10，不飽和度Ω= 20。通過對比1 和2的1H NMR 和13C NMR 數據可知（表1），化合物2也是1 個萘并吡喃-γ-酮二聚體。但是在1的1H NMR 譜圖的低場區，其中1 個螯合酚羥基質子信號向更低場移動至δH15.24（線型萘并吡喃-γ-酮螯合酚羥基質子的典型特征），表明化合物2的1個結構單元由角型轉變為線型。且比化合物1 多1個甲氧基質子信號δH3.43。經查閱文獻，鑒定化合物2 為已知化合物fonsecinone A［15］。核磁數據如表1 所示。通過培養成功獲得了化合物2 的單晶，并利用銅靶X-Ray 單晶衍射技術［16］確定了該化合物的軸手性為S。單晶數據如表2 所示，單晶結構見圖4。

圖4 化合物2的單晶ORTEP圖Fig.4 Perspective ORTEP drawing of compound 2

表2 化合物2的單晶衍射數據表Table 2 Crystal parameters of compound 2

化合物3，黃色粉末，［α］+ 87.5（c0.01 CHCl3），EI 質譜顯示分子離子峰為m/z570［M］+，與化合物2 的相對分子質量一樣。而比較兩者的1H NMR 和13C NMR 譜圖，發現其信號值極其相似。除了化合物3 中的2 個螯合酚羥基質子信號均處于更低場δH15.25 和δH14.83，故推測構成該化合物的2個單元均應為線型萘并吡喃-γ-酮。經檢索文獻，發現與化合物aurasperone A 核磁數據吻合，故鑒定化合物3 為已知化合物aurasperone A［17］。核磁數據如表1所示。

表1 化合物1～5的13C NMR（CDCl3）和1H NMR（CDCl3）數據表Table 1 The 13C NMR（CDCl3）and 1H NMR（CDCl3）data of compounds 1-5

化合物4，黃色粉末，［α］+ 17.0（c0.01 CHCl3），EI-MS 給出分子離子峰為m/z556［M］+，結合1H 和13C NMR 推斷該化合物的分子式為C31H24O10，不飽和度Ω= 20。對比化合物4 和2 的核磁數據可知，前者比后者少了1個甲氧基信號δH3.78，而其他信號基本一致。經文獻檢索，發現與化合物asperpyrone A 的核磁數據一致，故鑒定化合物4 為已知化合物asperpyrone A［18］。核磁數據如表1所示。

化合物5，淺黃色粉末，［α］+ 9.5（c0.01 CHCl3），EI-MS 給出分子離子峰為m/z556［M］+，結合1H 和13C NMR 推斷該化合物的分子式為C31H24O10，不飽和度Ω= 20。對比化合物5 和3 的核磁數據可知，前者比后者少了1個甲氧基信號δH4.00，而其他信號基本一致。經文獻檢索，鑒定化合物5 為已知化合物dianhydroaurasperone C［19］。核磁數據如表1所示。

5 結果與討論

軸手性是二聚萘并吡喃-γ-酮類化合物絕對構型確定時的一個難題。Koyama 等［20］和楊穎等［21］研究了chaetochromin A 及相似的二聚萘并吡喃-γ-酮類化合物的絕對構型。通過X-Ray單晶衍射數據分析，他們得出了化合物chaetochromin A 的軸手性構型為S，這與通過手性激子方法所得出的結果一致。經過多方研究驗證，他們得出了以下結論：以280 nm 為分割帶（從長波長往短波長看），當化合物出現先負后正的Cotton effect 吸收時，確定化合物為R-構型；而當化合物出現先正后負的Cotton effect 吸收時，確定化合物為S-構型。通過觀察化合物1～5 的CD 譜可知，五者均在280 nm 處具有先正后負的Cotton effect 吸收，因此可確定上述化合物均為S構型（圖5）。這與通過單晶確定的2的軸手性結果一致。

圖5 化合物1～5的CD曲線Fig.5 The CD spectra of compounds 1-5