miR-500在腎細胞癌中的表達及其生物學功能

楊匆匆，姚鵬，任文明，韓杰，徐玉節，程立

（皖南醫學院弋磯山醫院泌尿外科，安徽 蕪湖 241001）

腎細胞癌（renal cell carcinoma，RCC）是最常見的腎癌之一，約占成人惡性腫瘤的3%［1］，發病率和死亡率呈逐年上升趨勢［2-4］。由于RCC早期臨床特征不明顯，約有25%～30%的患者在明確診斷時已出現轉移，而轉移性RCC是一種難以治療的惡性腫瘤［5］，5年生存率低于10%［6-7］。隨著分子生物學技術的發展，微小RNA（miRNAs）的發現為癌癥的研究開辟了新的窗口。miRNAs是高度保守的大約18～24個核苷酸的非編碼RNA［8］，結合到mRNA的3＇UTR以調節基因表達［9-10］。它們已被證實參與多種生物過程，并在腫瘤發生和發展的調節中起關鍵作用［11-13］，被認為是腫瘤治療的潛在靶點。大量研究證明微小RNA-500（miR-500）的異常表達與肝細胞癌［14］、胃癌［15］、結直腸癌［16］、乳 腺 癌［17］、非 小 細 胞 肺 癌［18］、前 列 腺癌［19］等惡性腫瘤的進展相關。但鮮見miR-500與RCC相關的報道，本研究旨在探討miR-500在RCC發生、發展中的作用，為RCC的發生發展機制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本收集2020年1月至2021年2月在我院泌尿外科行手術治療且經病理組織學確診的36例RCC患者的腎癌組織和癌旁正常組織（可見RCC病灶外2.0 cm）。年齡30～86歲；男28例，女8例；T1期27例，T2期2例，T3+T4期7例。患者術前均未行放化療，且所有患者均簽署知情同意書。所有新鮮組織在切除后立即在液氮中快速冷凍保存。本研究經醫院倫理委員會批準。

1.2 細胞培養選取miR-500表達水平較低的RCC細胞株ACHN和KETR3，均購自上海中科院細胞庫。這2種細胞株保存在含有10%胎牛血清（FBS，美國Corning公司）的DMEM培養基（美國Gibco公司）中，并在37℃、5%CO2增濕培養箱中培養。

1.3 細胞轉染miR-500過表達引物（miR-500 mimics）及陰性對照引物（negative control，NC）購自中國上海生工公司。腎癌細胞株ACHN和KETR3接 種 于6孔 板 中 并 培 養24 h后，用Lipofectamine 3000（美國Thermo公司）進行細胞轉染。24 h后更換為新鮮培養液，轉染48 h后收集細胞，提取RNA，然后使用qRT-PCR驗證轉染后2種細胞株miR-500的表達，U6作為內參照。miR-500上游引物：5'-ATCCTTGCTACCTGGGTGAGA-3'，下游引物：5'-GCTCTCGCTCTCAGAATCCTT-3'；U6上游引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。引物大小為80 bp。程序95℃10 min、95℃15 s、60℃60 s、60℃20 s，40循環。

1.4 癌組織及癌旁正常組織中miR-500表達水平采用熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）技術檢測，按照試劑盒說明書。

1.5 細胞增殖實驗采用MTS法檢測細胞增殖情況。在37℃、5%CO2環境中，將RCC細胞株ACHN和KETR3以1×104/孔 的 密 度 接 種 到96孔 板 中，DMEM培養基最終體積為100 μl，6個重復孔。過夜附著后，將每個孔的細胞用5 pmol/L miR-500 mimics或NC進行轉染。孵育0、24、48、72 h后，用MTS法分析確定細胞活力。將MTS標記試劑（美國Promega公司）與新鮮DMEM培養基混合，并按照產品說明書孵育細胞2 h，使用VARIOSCAN FLASH（美國Thermo Fisher公司）在490 nm和690 nm波長下測量光密度，以此反映細胞增殖活性，并繪制細胞增殖折線圖。

1.6 細胞遷移實驗采用劃痕實驗檢測細胞遷移能力。將RCC細胞株ACHN和KETR3均勻接種在6孔板中，并使用Lipofectamine 3000將miR-500 mimics和NC轉染6 h。當細胞密度達到90%時，200 μl無菌移液管尖端劃出清晰的劃痕。然后將細胞用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗，并在無血清DMEM培養基中培養。在劃痕形成0和24 h后用數碼相機系統（日本奧林巴斯光學公司）獲取圖像。實驗重復3次。

1.7 細胞凋亡實驗運用流式細胞儀評價細胞凋亡程度。將細胞株ACHN和KETR3均勻接種到6孔板中。轉染48 h后，根據說明書，收集每個孔的細胞，包括漂浮細胞，并用5 μl碘化丙啶（PI）和5 μl膜聯蛋白V-熒光素異硫氰酸酯（KeyGEN）染色。在30 min內，使用流式細胞儀（美國Beckman公司）對每個樣品進行測量和分析。

1.8 統計學方法采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析。正態分布的計量資料采用配對樣本t檢驗和獨立樣本t檢驗進行比較，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1miR-500在腎癌組織中低表達36例RCC患者中29例癌組織中miR-500表達下調（圖1A）；RCC癌組織中miR-500的平均表達水平顯著低于癌旁正常組織（P＜0.01）（圖1B）。

圖1 RCC癌組織和癌旁正常組織中miR-500的表達

2.2 轉染結果qRT-PCR結果顯示轉染ACHN和KETR3細胞后，miR-500 mimics組miR-500的表達分別是NC組的（97.79±22.06）倍和（73.71±15.16）倍，差異有統計學意義（P＜0.01），見圖2。

圖2 ACHN、KETR3細胞轉染結果

2.3miR-500抑制RCC細胞的增殖MTS法結果顯示，miR-500 mimics組ACHN和KETR3細胞在24、48、72 h時，miR-500 mimics組細胞增殖速率較NC組明顯降低（P＜0.05）。見圖3。

圖3 miR-500抑制ACHN（A）和KETR3（B）細胞的增殖

2.4miR-500抑制RCC細胞的遷移劃痕實驗結果顯示，在轉染后24 h，與NC組比較，miR-500 minics組ACHN細胞和KETR3細胞的遷移距離分別減少了（32.06±16.92）%和（63.16±35.88）%（P＜0.05）。見圖4。

圖4 miR-500抑制ACHN和KETR3細胞的遷移

2.5miR-500誘導RCC細胞凋亡流式細胞術檢測結果顯示，轉染miR-500 48 h后，miR-500 minics組的ACHN細胞凋亡率較NC組細胞凋亡率顯著升高，分別為（19.10±1.89）%和（9.76±1.95）%（P＜0.01）；KETR3細胞的相應凋亡率分別為（9.85±0.28）%和（6.32±0.70）%（P＜0.01）。見圖5。

圖5 miR-500誘導ACHN和KETR3細胞凋亡

3 討論

腫瘤發生與多種基因的序列性改變有關，包括癌基因的激活和抗癌基因的功能障礙。大約50%以上的miRNAs基因位于與多種腫瘤相關基因區域或脆弱基因位點，這表明了miRNAs在諸多腫瘤的發生發展、遷移、增殖、凋亡等方面均有著重要生物學功能。一些miRNAs在RCC中表達明顯上調，如miR-210、miR-155和miR-21；另一些miRNAs，如miR-708和miR-145則表達降低［20］，這表示miRNAs不僅具有腫瘤促進作用，亦可能具有腫瘤抑制作用。

人類已發現miR-500在許多惡性腫瘤組織中的異常表達，并在癌癥發展中起著關鍵作用。如有研究發現miR-500表達在胃癌組織中明顯上調，但在正常胃組織中相對較低。結果表明miR-500通過激活核因子NF-κB信號傳導通路誘導胃癌細胞增殖和抗凋亡［15］。也有研究發現抑制miR-500，可以顯著抑制非小細胞肺癌細胞的增殖、遷移、侵襲和黏附，并誘導非小細胞肺癌細胞凋亡［18］。有報道miR-500在肝細胞癌患者的血清和腫瘤組織中大量表達，但在腫瘤切除后可恢復至基線水平［14］。也有實驗證實miR-500的靶向敲低顯著提高了前列腺癌細胞中低密度脂蛋白受體相關蛋白1B（LRP1B）的水平，使前列腺癌細胞周期停滯在G1期，進而抑制細胞增殖［19］。此外，長鏈非編碼RNA LINC00641靶向調控miR-500的表達抑制結腸癌細胞增殖、遷移及侵襲［16］。然而，關于miR-500在RCC中的表達特征或功能機制知之甚少。

本研究首先采用qRT-PCR技術檢測36例RCC癌組織和癌旁正常組織中miR-500的表達水平，結果顯示RCC癌組織中miR-500表達水平顯著低于癌旁正常組織，這說明miR-500有可能是一種調控RCC發展的抑癌基因。為了進一步探討miR-500水平對RCC發展的影響，本研究通過將2種RCC細胞系ACHN和KETR3進行miR-500過表達后，分析了miR-500上調對RCC細胞增殖、遷移和凋亡的作用。結果表明，miR-500上調顯著抑制了2種RCC細胞的增殖與遷移能力，并誘導了細胞凋亡增加。研究結果對miR-500在RCC發生發展、遷移、增殖、凋亡等方面中的作用及可能機制提供了全新思路。

綜上所述，在RCC細胞系ACHN和KETR3細胞中，miR-500能抑制其增殖和遷移，誘導凋亡增加，在RCC中發揮著重要生物學作用。miR-500可能是未來RCC生物治療的新靶點，應進一步研究探索miR-500的生理作用及靶基因。