貴州八角葉枯病病原菌鑒定及生物學特性研究

張曉勇, 鄒東霞, 張 鳳, 黃乃秀, 廖旺姣, 嚴 凱*

(1. 廣西特色經濟林培育與利用重點實驗室, 南寧 530022; 2. 六盤水師范學院生物科學與技術學院, 六盤水 553004)

八角IlliciumverumHook.f是重要的調料和藥用植物,經濟價值高。在八角栽培中,炭疽病(anthracnose)[1-2]、白粉病(powdery mildew)、煤污病(sooty blotch)和藻斑病(algal leaf spot)[3]等常給八角產量和質量造成嚴重的影響。2020年8月,我們在對貴州省六盤水市盤州市八角林間調查發現,八角植株普遍發生葉枯病,發病初期在葉尖端、葉緣形成圓形、橢圓形或不規則形的灰褐色病斑,病健交界明顯,后期隨著病斑擴展，整個葉片干枯死亡,整體呈灰白色,枯死部分正面有密集的小黑點,故將該病命名為葉枯病(圖1a～b)。目前,引起該病害的病原菌尚不明確。

為明確引起貴州八角葉枯病病原菌種類,本文采用形態學結合多基因分子生物學的方法對病原菌進行鑒定,并對病原菌生物學特性進行研究,旨在為八角葉枯病的田間識別及防治提供理論及實踐參考。

1 材料與方法

1.1 病害標本采集與病原菌分離純化

供試的八角葉枯病典型病害材料于2020年8月采自貴州省六盤水市盤州市大山鎮嘎拉河村(104°41′E, 25°33′N,海拔2 118 m)。采集新鮮感病樣品帶回實驗室后采用單孢分離法對患病葉片病原菌進行分離和純化。菌株在PDA斜面上培養7～10 d后置于4℃保藏備用。

1.2 病原菌的鑒定

1.2.1形態學鑒定

1)菌株生長速率測定。將4℃保藏的菌株接種到PDA平板上,于25℃的黑暗條件下培養5 d后用直徑6.0 mm滅菌打孔器打取菌落邊緣菌塊接入另一PDA平板中央,在25℃的黑暗條件下培養5 d后采用十字交叉法測量菌落直徑,觀察菌落特征。設置5次重復。

2)產孢誘導。將干松針剪成2～3 cm的小段,在121℃下滅菌15 min,3 d 后再進行第2次滅菌制得雙重滅菌松針。取5～6根滅菌松針均勻撒在合成低營養瓊脂培養基(synthetic nutrient poor agar,SNA)(KH2PO40.2 g,KCl 0.2 g,KNO31.0 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,葡萄糖0.2 g，蔗糖0.2 g,瓊脂20 g,水1 000 mL,自然pH)平板表面作為產孢誘導培養基[4]。待菌株活化后用直徑6.0 mm滅菌打孔器打取菌落邊緣菌塊以3點法接入上述培養基平板上,在25℃的自然光照條件下進行培養。待松針上有滴狀、黑褐色子實體形成后,挑取子實體以無菌水制作臨時裝片,用Olympus BX51顯微攝像系統拍攝產孢細胞和分生孢子的顯微結構,并用SPOTCam 32繪制標尺和測量顯微尺寸。

1.2.2分子生物學鑒定

1)病原菌DNA提取。將供試菌株分別接種于PDA平板培養基上,置于25℃、黑暗條件下培養7 d后刮取菌絲,用改良的CTAB法提取DNA[5]。

2)目的基因的擴增與序列測定。擴增的目的基因序列分別為內轉錄間隔區(ITS)、β-微管蛋白基因(TUB)和翻譯延伸因子1-α基因(tef1)。ITS基因選用真菌rDNA-ITS 通用引物ITS4和ITS5[6];TUB基因選用引物BT2A和BT2B[7];tef1基因選用引物EF1-526F和EF1-1567R[8],反應體系及擴增程序參考Maharachchikumbura等的方法[9]。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后,由北京擎科生物科技有限公司進行純化和雙向測序。將所得序列輸入GenBank的BLAST中進行同源序列檢索,查找相似性較高的菌株(表1)。3個基因序列用Sequence Matrix 1.7.8進行拼接,用MEGA 11 軟件以極大似然法(maximum likelihood method, ML)構建系統發育樹,確定菌株的分類地位。

表1 參與多基因系統發育分析的菌株及序列登錄號信息1)

1.3 致病性測定

選取健康無損傷的離體成熟八角葉片,先用75%乙醇擦拭葉片表面,無菌水清洗5次,再用滅菌吸水紙擦干表面水珠。葉柄切口處用無菌濕棉球包住后平置于培養皿內進行保濕培養。用滅菌大頭針在直徑5 mm的葉片區域內刺傷5點形成微創傷口。吸取50 μL的106個/mL病原菌孢子懸浮液滴于微創傷口上,另一組在微傷口處接種等體積無菌水,以在未進行損傷處理葉片的相同部位接種50 μL病原菌孢子懸浮液為對照。接種后蓋好皿蓋放置于20℃、光照條件下培養7 d觀察發病情況,試驗設置5次重復。

1.4 病原菌適宜生長溫度及pH測定

在活化菌株菌落邊緣打取6 mm菌餅接種于PDA平板,分別置于0、5、10、15、20、25、30℃和35℃等8個溫度環境中,黑暗條件下培養5 d后測量各溫度下的菌落直徑(mm)。用1.00 mol/L的NaOH或HCl調節PDA培養基的 pH,配制成初始pH分別為4、5、6、7、8、9、10、11和12等9個梯度的培養基,滅菌后倒平板,從菌落邊緣打取6 mm菌餅接種于不同pH值的PDA平板中央, 25℃黑暗條件下培養5 d后測量各個處理菌落直徑(mm)。用移液槍吸取100 μL 106個/mL孢子懸浮液加入PDA平板,均勻涂布后分別置于上述幾個溫度和pH環境中。24 h后將平板置于光學顯微鏡的10×10低倍鏡下隨機選取10個視野統計分生孢子萌發情況。每處理設置5次重復。孢子萌發率=視野中孢子萌發數/孢子總數×100%。

1.5 病原菌菌絲和孢子致死溫度測定

用滅菌打孔器在菌株菌落邊緣打取4 mm的菌餅裝入1.5 mL無菌離心管中,加入1.0 mL無菌水后蓋上離心管,分別放入35、40、45、50、55、60、65℃和70℃水浴中,精確計時10 min后取出菌餅,用無菌濾紙吸干水珠后以單點法接于PDA平板中央,25℃、黑暗條件下培養5 d后測量菌落直徑。取1.0 mL 的106個/mL孢子懸浮液加入1.5 mL無菌離心管中,蓋好蓋子后分別投入上述7個溫度的水浴中精確計時處理10 min,取各溫度處理的100 μL孢子懸浮液均勻涂布于水瓊脂(WA)平板上,25℃、黑暗條件下培養24 h后將平板置于光學顯微鏡的10×10低倍鏡下隨機選取10個視野統計分生孢子萌發情況。每個溫度設置5次重復。

2 結果與分析

2.1 八角葉枯病癥狀觀察

在八角葉片上,病害初期在葉片尖端、葉緣或葉上形成圓形、橢圓形或不規則形的灰褐色病斑,病健交界明顯,后期隨著病斑擴展導致整個葉片干枯死亡,整體呈灰褐色。葉片干枯壞死部分向上卷曲,幾乎不形成穿孔(圖1a～b)。發病后期在病斑處可見密集的小黑點狀分生孢子盤,單生或連成片(圖1c)。

圖1 八角葉枯病癥狀及菌株致病性測試Fig.1 Symptoms of Illicium verum leaf blight and pathogenicity test

2.2 病原菌分離與致病性鑒定

通過單孢分離法從典型病斑部位共分離獲得3個純化菌株(編號為IP202082702、IP202082705和IP202082706)。將菌株IP202082702孢子懸浮液接種于健康八角葉片上,20℃下培養7 d 后,與刺傷不接種處理相比,接種處形成6～7 mm的灰褐色壞死病斑,與田間早期癥狀一致(圖1d～e)。繼續培養待病斑上產生子實體后,再次挑取分生孢子進行單孢分離,所得菌株形態特征與原菌株一致。無傷接種處理則未出現病斑(圖1f),說明該病原菌主要靠傷口或葉片邊緣結構侵入葉片而致病。

2.3 病原菌的鑒定

2.3.1病原菌形態學鑒定

菌株在PDA上于25℃、黑暗條件下培養5 d后,菌落平均直徑為(61.67±0.58)mm(n=3)。菌落表面平整,白色至淡黃色,絨毛狀,有明顯的輪狀花紋,質地相對緊密,背面中央呈淺橙色,至邊緣逐漸減淡為白色(圖2a～b);培養12 d以后,菌株在SNA培養基中的松針上形成黑色子實體,球形,淚滴狀,200～500 μm(圖2c)。

分生孢子梗透明,表面光滑,亞圓柱狀,長為17.22～37.09 μm,產孢細胞安瓿瓶狀、透明,長12～23.2 μm(圖2d～e)。分生孢子紡錘狀,直或略微彎曲,4個隔5個細胞,分生孢子長19.21～29.65 μm,平均(22.95±2.56)μm (n=30),寬6.47～9.77 μm,平均(8.73±0.51)μm (n=30)。基部細胞倒圓錐形,長3.27～6.61 μm,無色、透明;中間3個細胞甕形,表面具有密集的小疣點,同色,淺棕色到棕褐色,長12.79～17.18 μm,平均(14.87±2.21)μm (n=30),隔比孢子外側壁厚,黑褐色。頂部細胞無色、透明、倒圓錐形,長2.16～4.08 μm;頂端附屬絲1～4根,多為3根,從孢子頂端不共點分出,長14.56～31.97 μm,平均(21.13±3.48)μm (n=30),透明絲狀,不分支;中生式基部附屬絲1根,長4.26～7.33 μm,平均(5.53±1.26)μm (n=30)(圖2f～k)。通過與該屬已知種進行比較,初步將3株菌株鑒定為廬山擬盤多毛孢PestalotiopsislushanensisF.Liu & L. Cai[8]。

圖2 八角葉枯病病原菌形態特征Fig.2 Morphological characteristics of Pestalotiopsis lushanensis

2.3.2病原菌分子生物學鑒定

將3個病原菌菌株的ITS、TUB和tef1序列與GenBank中下載的20個菌株相關基因序列進行同源性比對,以SequenceMatrix1.7.8進行拼接,用MEGA 11以SeiridiumcamelliaeSD096為外群構建的ML系統發育樹如圖3所示。本研究分離的3株菌株IP202082702、IP202082705和IP202082706與廬山擬盤多毛孢P.lushanensis以99%的高支持率聚為一支,支持形態學鑒定結果,故基于形態學和分子生物學特征將3個菌株鑒定為廬山擬盤多毛孢P.lushanensisF. Liu & L. Cai。

圖3 基于ITS、TUB和tef1構建的廬山擬盤多毛孢及其相關菌株的ML系統發育樹Fig.3 ML phylogenetic tree based on combined sequences of ITS, TUB, and tef1 genes of Pestalotiopsis lushanensis and relative strains

2.4 不同培養溫度和 pH 對病原菌生長及孢子萌發的影響

不同培養溫度和 pH 對病原菌菌絲生長及孢子萌發影響如圖 4所示。在10～35℃范圍內該菌菌絲均可生長,孢子可萌發,適合菌絲生長和孢子萌發的溫度范圍為20～30℃,最適為25℃,當溫度超過 35℃后菌絲基本停止生長(圖4)。該菌對培養基 pH的要求不嚴格,在 pH 4～12 范圍內孢子可部分萌發,菌絲可生長,但在pH 6～7時菌落直徑最大;分生孢子在 pH 6～10萌發率均較高(圖4)。說明該菌菌絲生長和孢子萌發最佳溫度為25℃,最適pH為6～7。

圖4 不同溫度和 pH 對廬山擬盤多毛孢菌絲生長及孢子萌發的影響Fig.4 Effects of different temperatures and pH values on mycelial growth and conidia germination of Pestalotiopsis lushanensis

2.5 病原菌致死溫度

病原菌菌絲和孢子在不同溫度下處理10 min后其菌落直徑和孢子萌發率如圖5所示。隨著處理溫度的升高,菌落直徑和孢子萌發率均隨之急劇降低,當處理溫度達到50℃時菌絲停止生長,達到55℃時孢子萌發率降為0。說明病原菌的菌絲致死溫度為50℃處理10 min,分生孢子致死溫度為55℃處理10 min。

圖5 廬山擬盤多毛孢菌絲和分生孢子在不同溫度下處理10 min的效果Fig.5 Effects of treatment for 10 min under different temperatures on mycelial growth and conidia germination of Pestalotiopsis lushanensis

3 結論與討論

擬盤多毛孢屬中很多真菌是植物病原菌,常危害植物葉片、枝條、果實和根系,引起葉斑、葉枯、枝枯、果實黑斑病、軟腐病和根腐病等[10-14],對很多植物的生長造成嚴重影響。本文基于形態學結合ITS、TUB和tef1多基因序列分析,將八角葉枯病病原菌鑒定為廬山擬盤多毛孢Pestalotiopsislushanensis。廬山擬盤多毛孢是Liu等[8]在2017年報道的新種,其模式標本采自江西廬山國家公園的山茶屬植物。到目前為止,已報道廬山擬盤多毛孢引起茶Camelliasinensis的灰枯病[15]和草珊瑚Sarcandraglabra的褐斑病[16],這是廬山擬盤多毛孢在八角上的首次報道。

傳統上,擬盤多毛孢屬真菌的分類主要基于分生孢子形態特征,如分生孢子3個中間細胞顏色、分生孢子大小及頂端附屬絲、基部中生式柄的形態和數量等[17]。但隨著對該屬研究的深入,報道的種越來越多,以分生孢子顏色和大小來進行分類是非常困難的,多基因序列分析也證明僅靠形態學分類很難鑒定到種,而且形態特征與菌株培養條件有關[4]。多基因分子鑒定是對傳統形態學鑒定的有效補充。本文結合ITS、TUB和tef1多基因序列分析(圖3)發現,廬山擬盤多毛孢P.lushanensis近緣種有杜鵑擬盤多毛孢P.rhododendri和P.clavata,3個種的分生孢子大小和顏色相近,但是杜鵑擬盤多毛孢頂端附屬絲(7.5～14.9 μm)和基部附屬絲(2.8～4.9 μm)都明顯短于廬山擬盤多毛孢(12.79～17.18 μm和4.26～7.33 μm)[18],P.clavata基部附屬絲(7～9 μm)明顯長于廬山擬盤多毛孢[9]。前人在八角上報道的擬盤多毛孢屬真菌有八角擬盤多毛孢P.ilicis和金毛狗擬盤多毛孢P.cibotii,兩個種的分生孢子大小、顏色及基部附屬絲、頂端附屬絲長度與廬山擬盤多毛孢也有顯著差異[17,19]。

本研究還對八角葉枯病新病原菌廬山擬盤多毛孢生物學特性進行了研究。結果表明,該菌在10～35℃和pH 4～12范圍內其菌絲均可生長,孢子均可萌發,說明該菌株對環境的適應性較強,但10℃以下的低溫和35℃以上的高溫對該菌菌絲生長和孢子萌發影響較大,說明溫度是影響該菌侵入、擴展和發病的關鍵因素之一。致死溫度測試表明,50℃處理10 min后菌絲停止生長,55℃處理 10 min 后孢子無法萌發,說明孢子對高溫的耐受性高于菌絲,與李陽的研究結果一致[20]。本文對八角葉枯病新病原菌的生物學特性進行研究,為該病害的田間流行監測、發生規律和防治方法提供理論和實踐參考。