我國城鄉泡桐叢枝病區域差異因子分析

孔德治, 田國忠, 張文鑫, 王圣潔, 宋傳生, 鄧寶紅,郭民偉, 樸春根, 林彩麗*

(1. 中國林業科學研究院森林生態環境與自然保護研究所,國家林業和草原局森林保護學重點實驗室, 北京 100091;2. 中國林業科學研究院熱帶林業研究所, 廣州 510520; 3. 菏澤學院, 菏澤 274015;4. 河南南陽國家農業科技園區, 南陽 473037)

泡桐為泡桐科Paulowniaceae泡桐屬Paulownia木本植物[1],是原產于中國且很早被人工栽培利用的優良樹種之一,其木材廣泛應用于建筑、家具、造紙和樂器等領域。宋代陳翥[2]撰寫的《桐譜》為我國首部泡桐科技專著,至今仍具有一定的科學價值。泡桐樹態優美、花序大而艷麗;葉大而具毛,凈化空氣能力強,也是綠化城市和工礦區及庭院、鄉村四旁的好樹種[3]。

泡桐叢枝病是由植原體引起的一種危害嚴重的林木病害。植原體專性寄生于泡桐韌皮部篩管內,引起腋芽和不定芽大量萌發,節間縮短,花器變態,葉片黃化等癥狀。1967年日本DOI等[4]首次發現這類新病原,20世紀70至80年代金開璇等[5]和Joon等[6]學者分別證實了發生在中國和韓國的泡桐叢枝病為同一病原,此后許多學者針對泡桐叢枝病的發生規律與防治技術等方面進一步開展研究,明確了該病害是通過種根、種苗等營養繁殖材料和媒介昆蟲進行傳播[7-10]。20世紀60年代以來,我國曾大規模開展泡桐造林,但這一過程也造成了泡桐叢枝病的暴發與流行。經調查統計,泡桐叢枝病在重病區發病率可超過80%,而且隨著泡桐樹齡的增加,發病率呈上升趨勢[11]。迄今在北至山海關、南至長江流域的廣大范圍內,有19個省、直轄市、自治區報道有泡桐叢枝病發生,發生面積22 252.6 hm2,給泡桐的生產帶來了重大危害與損失[12-13]。在病害防治方面,20世紀90年代建立的溫度處理結合莖尖培養組培脫毒、PCR檢測技術和脫毒組培苗快繁技術為解決種根和種苗傳病問題提供了有效解決方案[14]。

此前針對該病害發生與危害的詳細調查數據多集中在局部的重病區與用材林人工栽培區,全國性調研與區域間比較的數據甚少,僅有崔曉琦等[15]使用經緯網格布點法選點調查該病害的地理變異規律的一篇研究報道,或作為泡桐種類資源調查的輔助調研內容,其研究也缺乏病原分子檢測與鑒定技術佐證;而針對城市市區泡桐叢枝病的發生狀況,僅有北京和鄭州兩市的文獻報道[15-16]。雖然近些年來于少帥等[17]、宋傳生等[18]對16Sr I組植原體特別是泡桐叢枝植原體株系的分子變異研究報道,但尚不確定我國泡桐叢枝植原體中是否存在不同致病力菌株。

2018年3月至2020年11月在黃淮海、西北、西南和江南四大區域內選取代表性的泡桐種植調查點,對泡桐叢枝病開展普查和典型調查研究,采集發病泡桐樣品進行外植體組織培養和植原體檢測。以期通過研究獲得關于該病害的最新擴散與危害信息,揭示不同泡桐種類和地理環境等相關因子對病害區域分布、擴散和危害程度的影響,解析導致我國泡桐叢枝病危害程度地域差異的原因,為不同區劃制定更有針對性的病害預防和治理對策奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 泡桐種的分類與識別

參考相關泡桐專著識別的泡桐種類包括白花泡桐Paulowniafortunei、蘭考泡桐P.elongata、毛泡桐P.tomentosa、楸葉泡桐P.catalpifolia、臺灣泡桐P.taiwaniana、華東泡桐P.kawakamii、山明泡桐P.lamprophylla、川泡桐P.fargesii、鄂川泡桐P.albiphloea、成都泡桐P.albiphloeavar.chengtuensis及部分中間類型,無法識別的中間類型統一歸為天然或人工雜交種類或無性系,部分未識別類型歸為未知型[19-21]。

泡桐優良品種(系)3個:ZL-3為白花泡桐×毛泡桐天然雜交種P.fortunei×P.tomentosa、XUH為宿縣毛泡桐優系P.tomentosa、C020為白花泡桐優系P.fortunei。

1.2 調查地點和方法

在《泡桐栽培學》[3]中我國泡桐分布區的基礎上劃分為4個區域:黃淮海暖溫區、西北干旱區、西南亞濕熱區和江南溫暖濕潤區;分別在其中選取代表性調查點分布于16個省的37個市(縣);調查地點分為城區、郊區、縣域及鄉鎮;栽植類型包括散植、集中栽植、行道樹或片林。采用重點樣地調查與隨機踏查相結合的方式,對不同地區泡桐栽植點2年以上樹齡的泡桐發生叢枝病情況進行普查,逐株記載樹齡(部分估測)、叢枝病株和叢枝病嚴重程度,并考察栽植方式和立地條件。

1.3 病情分級與病情指數計算

在李榮幸等[22]的野外泡桐發病嚴重程度分級標準的基礎上進一步優化,共劃分為5個等級。0級:健康無癥;Ⅰ級:僅有1～2個小的叢枝,占樹冠的10%以下;Ⅱ級:有1～2個大的叢枝或較多小叢枝,占樹冠的10%～20%;Ⅲ級:有2個以上大的叢枝,占樹冠的20%～50%;Ⅳ級:有多個大的叢枝或整株叢枝,占樹冠的50%以上。

對組培條件下培育4個月以上的13組帶菌泡桐組培苗按發病嚴重程度不同共分為5個等級。0級:健康無癥;1級:小葉占全株的10%以下;2級:小葉占全株的10%～50%;3級:小葉占全株的50%以上;4級:小葉占全株的50%以上且頂芽出現膨大,植株分化受抑制。

發病率和病情指數的計算公式:

選取年均溫度、降水量、濕潤度、干燥度、≥0℃積溫、≥10℃積溫和太陽輻射強度7個氣候因子,所有氣候數據來源于1980年-2015年全國氣象站觀測數據,通過整理、計算和空間插值處理生成。氣候數據的插值應用澳大利亞的ANUSPLIN插值軟件,ANUSPLIN是一種采用平滑樣條函數對多變量數據進行分析和插值的工具,能夠對數據進行合理的統計分析和數據診斷,并可以對數據的空間分布進行分析進而實現空間插值的功能[23]。插值后根據調查樣點的經緯度利用ArcGIS 10.4提取各調查樣點的氣候因子數據。用Excel、SPSS 26.0軟件對泡桐叢枝病病情指數與氣候因子數據進行相關分析和回歸分析。

1.4 休眠枝水培與外植體組織培養

野外采集休眠泡桐發病枝條,長度為36～50 cm,用自來水進行表面洗滌,之后放入口徑25 cm、高26 cm的10 L的塑料桶內,并加入適量清水,在溫室內25℃連續光照下水培促其萌芽,每7 d更換桶內清水。

外植體組培:剪取在溫室內水培30～60 d后泡桐休眠病枝萌發的幼嫩新芽(去掉葉片),自來水沖洗2 h,75%乙醇處理30 s,0.1%升汞溶液中消毒5～15 min,用滅菌水洗滌后,截成2～3 cm具節莖段,接種于固體MS基礎培養基上,于25℃組培室內培養,光照時間14 h/d,光照強度15 00～2 000 lx。15 d至1個月間隔轉接至新培養基上,之后在1～2個月間隔內繼代培養1次。

1.5 DNA提取與病原檢測方法

植物總DNA的提取,參照CTAB法植物基因組DNA快速提取試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司,DN14)說明書稍加改動。取待測泡桐新鮮組織約0.3 g或干組織約0.1 g,抽提植物總DNA,并將其保存于-20℃備用。以植原體16S rDNA基因引物對R16mF2/R16mR1和R16F2/R16R2[24-25](北京六合華大基因有限責任公司合成),進行直接PCR和巢式PCR,PCR擴增體系及反應條件參考Gundersen等[24]、Lee等[25]的方法。陽性對照為本實驗室保存的泡桐叢枝植原體病株DNA,陰性對照為健康泡桐植株DNA,空白對照為DEPC處理的無菌超純水。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物,直接PCR和巢式PCR預期片段長度分別為1.4 kb和1.2 kb。LAMP檢測采用王圣潔等[26]報道的方法進行,LAMP擴增的引物包括正向外引物PaWB-F3、反向外引物PaWB-B3、正向內引物PaWB-FIP、反向內引物PaWB-BIP(生工生物工程上海股份有限公司合成)(表1)。

2 結果與分析

2.1 我國部分城鄉地區泡桐叢枝病分布與發生危害趨勢

2018年-2020年對我國4大泡桐分布區內選取的37個代表性城市與鄉鎮的泡桐叢枝病病害調查結果顯示,黃淮海暖溫區和西北干旱區是該病害發生的重病區,西南亞濕熱區次之,江南溫暖濕潤區最輕(表2)。由南向北,該病害整體呈現加重趨勢,這一結果與之前積累的調查數據相吻合(未發表數據)。本研究首次對云、貴、川的西南地區隨機抽樣調查結果顯示,這一大區的發病率和危害程度都在中等程度。而在湖南省郴州市莽山以南的地區,泡桐樹為零星分布,未發現泡桐叢枝病危害。

本次調查數據也顯示了一些與以往報道不同的病害危害狀況與變化趨勢。在黃淮海傳統重病區的河南商丘市和開封市局部地區集中栽植的中幼齡泡桐、山東青島和日照市城鄉散植的成年泡桐叢枝病發病率和病情指數都明顯較低。而在西北干旱區的山西局部地區則病害有加重的趨勢,其中臨汾汾河生態公園集中栽植的泡桐和交城縣城栽植的行道樹發病率與病情指數都很高。對福建福州、南平與河南商丘分別進行的兩次動態病害調查分析,其發病程度均呈現逐年加重的趨勢,表明處于毒源附近的中、幼林的整體病害發展較快。

在一般情況下,同一地區的主城區與郊縣、鄉鎮的泡桐叢枝病總體發病率和危害程度存在大體一致性,即城區危害重的其郊區鄉鎮也偏重,反之亦然。但是當地較大規模集中栽植于特定環境、不同樹齡或不同種的片林局部發病狀況會呈現特殊性,顯著重于或輕于當地的平均嚴重程度。該病害嚴重破壞樹木干型、冠型、開花和綠化美化及空氣凈化能力,且發病樹齡越大危害越重。北方城區散植20～30年以上樹齡的泡桐多為蘭考泡桐,其病樹的病級常低于同種中幼齡病株病級,似乎表現出一定的成年株抗病或耐病特性。

表2 2018年-2020年中國部分地區泡桐叢枝病病情調查結果

續表2 Table 2(Continued)

2.2 不同種的泡桐感病性和叢枝癥狀多樣性觀察

野外踏查發現我國長江以南地區白花泡桐分布最普遍、其次為臺灣泡桐和華東泡桐。本研究首次發現在福州市福道景區集中人工栽植的臺灣泡桐發病較重,表現為發病率高和叢枝癥狀重,而白花泡桐發病相對較輕(病枝多發生在樹冠內膛枝，節間縮短和小葉程度較輕);進一步對福建福州、南平,湖南衡陽和郴州的調查結果都顯示了臺灣泡桐比白花泡桐更感病;但在貴州遵義栽植的這兩種泡桐的感病程度差異減小(表3)。西南亞濕熱區有白花泡桐、華東泡桐、鄂川泡桐、臺灣泡桐和川泡桐分布,成都市區主要為鄂川泡桐、川泡桐和成都泡桐,昆明市區的臺灣泡桐和川泡桐比例較高。這一區域川泡桐似乎更感病,而白花泡桐、華東泡桐等感病程度較輕。

表3 白花泡桐與臺灣泡桐叢枝病調查結果

在田間踏查時發現部分染病泡桐存在越季(秋季)異常開花的現象,即在泡桐當年生長的10月-11月正?；ɡ侔l育完成階段,病樹上的正常發育花蕾當年提早開放,花冠正常;而健康植株的花蕾要次年春季才能正常開花。已發現這種現象的地區有浙江杭州、江西上饒、山西臨汾、河南南陽、開封、河北保定、北京等地區,泡桐種類包括毛泡桐、蘭考泡桐、白花泡桐及雜交泡桐等。初步觀察發現越季開花與叢枝病發生之間存在著很高的相關性,即出現越季開花的泡桐樹幾乎皆為叢枝病株;但一般表現嚴重叢枝和變葉的病株或病枝上,因無正?；ɡ侔l育,故無越季開花可能;而最常見的狀況是靠近叢枝的無癥枝、或大病枝上的小無癥枝,或出現小病枝的大無癥枝上出現越季開花現象(圖1)。

圖1 泡桐叢枝病病株上的越季異常開花(拍攝于2019年11月,山西臨汾)Fig.1 Off-season blooming of the diseased paulownia tree associated with phytoplasma infection (Photographed in November 2019 in Linfen of Shanxi province)

2.3 氣候因子與泡桐叢枝病相關性分析

雙變量線性回歸分析結果(圖2)顯示,泡桐叢枝病發病率和病情指數與溫度相關因子年均溫度、≥0℃積溫和≥10℃積溫、水分相關因子年均降水量、濕潤度和干燥度及日均太陽輻射強度共7個氣候因子相關性均達到顯著水平。發病率和病情指數與年均溫度、年均降水量、濕潤度、≥0℃積溫、≥10℃積溫呈負相關關系;與干燥度、日均太陽輻射強度呈正相關關系。采用逐步回歸法分析得出,病情指數與7個氣候因子中年均降水量相關性最高,R2為0.579,P<0.001,F值(方差檢驗)為57.69。

線性回歸方程預測,年均溫低于14℃時,病害發生嚴重;年均溫高于19℃時,病害普遍較輕;年均降水低于610 mm時,病害發生嚴重;年均降水高于1 450 mm時,病害普遍較輕。在回歸方程的散點圖中,鄉鎮與人工林的坐標點多數離散值較大。

2.4 不同生境與栽植方式下病害發生情況

對重病區的河南和山西的片林與集中栽植林地的病害調查結果顯示,因生境、栽植方式、樹齡、種類等不同而導致的病害發病率和病情指數的差異很大。隨著樹齡增大,發病率與病情指數均明顯加重,比如河南商丘黃河故道森林公園生長20年以上的純林發病率達94.6%,病情指數達56.1,這與以往報道結果類似。一些綠化工程造林地病害嚴重程度較高,比如山西臨汾和交城;但另一些造林工程地中幼林的發病程度則比以往報道的同齡林明顯減輕,比如河南蘭考泡桐森林公園、民權森林公園、商丘森源駕校等。對本實驗室前期栽種的泡桐脫毒苗示范林地的追蹤調查結果顯示(表4),脫毒苗在南方造林地比北方造林地叢枝病明顯減輕;在黃淮海暖溫區南陽,宿縣毛泡桐(XUH)抗病性表現明顯強于感病‘中林3號’泡桐無性系(ZL-3),但隨著樹齡的增大,宿縣毛泡桐的病情也在逐漸加重。

2.5 不同地區、不同種類泡桐休眠病枝水培萌條檢測與外植體組織培養觀察

從17個泡桐休眠病枝水培萌芽樣品中(表5),直接PCR共檢出11個植原體感染陽性樣品(圖3);用巢式PCR進一步檢出2個陽性樣品;LAMP共檢出13個樣品(圖4);泡桐休眠病枝萌發新芽的植原體綜合檢出率為76.5%。根據對泡桐休眠期采集的泡桐叢枝的病原檢測、組培癥狀觀察結果判斷各地采集的離體越冬休眠枝水培萌芽仍攜帶存活植原體,進一步驗證也支持了泡桐叢枝植原體可在地上部成活越冬,而不必下行至根部越冬的觀點。

圖2 泡桐叢枝病病情指數與氣候因子線性回歸分析Fig.2 Linear regression analysis between disease index of paulownia witches’-broom disease and climatic factors

表4 泡桐脫毒苗造林叢枝病調查1)

表5 野外采集泡桐越冬休眠叢枝室內水培萌芽植原體檢測1)

圖3 泡桐叢枝病樣品的直接PCR和巢式PCR檢測Fig.3 Detection of PaWB samples by direct PCR and nest-PCR

通過對休眠病枝萌芽外植體的組織培養,成功獲得了來自福建、四川、江蘇、山西、陜西5個省份共計13組帶菌泡桐組培苗。連續繼代培養后,對不同地理來源、不同種類泡桐的組培苗癥狀嚴重度進行比較(表6),結果顯示除陜西省西安市興慶宮楸葉泡桐病情指數相對較低(32.2)外,其他來源組培苗的發病率和病情指數皆很高,分別達93.3%～100%和52.1～76.9;不同種類泡桐單株組培苗癥狀對比發現,白花泡桐和楸葉泡桐癥狀相對較輕(3級),臺灣泡桐、蘭考泡桐、毛泡桐和陜桐均能達到4級。來自不同地區的發病泡桐經組培繼代后,組培苗的發病癥狀均高于田間自然條件下生長的泡桐,尤其是來自福建的組培苗與田間生長的泡桐發病癥狀差異最明顯。

圖4 泡桐叢枝病樣品的LAMP檢測Fig.4 Detection of PaWB samples with LAMP

表6 來源于不同地區感染植原體的不同種類泡桐組培病苗連續繼代培養癥狀嚴重度觀測

3 討論

本研究首次嘗試將我國泡桐叢枝病根據嚴重程度和氣候類型劃分為4個不同區域;特別關注和比較了城區與郊區鄉鎮四旁及其他人工泡桐林叢枝病害的發生特點;初步解析了我國泡桐叢枝病南方輕、北方重的可能原因,將關鍵因子聚焦到了氣候、寄主抗性、種苗帶菌等因素。這些研究結果將為針對不同生境的泡桐叢枝病制定綜合防控策略與科學決策提供理論依據。

總體來看,與20世紀60至80年代我國泡桐叢枝病大發生期相比,現階段的病害發生處于相對平穩狀態,許多泡桐主栽區中幼齡泡桐病害發生與受害明顯減輕,1～3年生幼林發病率低至0～5%(以往報道在2%～30%);江南地區未出現大規模、區域性的暴發和流行。但黃淮海暖溫區和西北干旱地區成年泡桐發病總體上仍較為嚴重[5,27-29]。在京津冀地區實地踏查發現有白花泡桐的分布,且黃淮海地區的病害普遍高于長江流域的湖北地區,補充修正了崔曉琦等的研究結果[15]。長江以南,嶺南以北的江西、湖南、福建等省份總體為零星病區,該地區主栽的白花泡桐病害發生很輕;但也發現局部栽植較多的臺灣泡桐叢枝病相對較重。關于福建省泡桐叢枝病的記錄,最早見于1980年金開璇[27]的報道,但在《中國林業有害生物: 2014-2017年全國林業有害生物普查成果》中福建未被列為分布區[14],本研究則進一步明確了福建為病害零星分布區。據文獻報道,與福建隔海相望的臺灣島在1974年即報道了在臺灣泡桐P.taiwaniana和白花泡桐P.fortunei有叢枝病的發生,且蔓延較快,其中白花泡桐較耐病[9]。此前對西南地區該病發生和流行學調研數據和文獻報道很少,本次調查填補了這方面的空白,并發現該地區川泡桐發病嚴重,而貴州貴陽和遵義市區白花泡桐的感病程度相比江南地區較重,這是否為不同生境對其感病性產生了影響尚待證實。

在泡桐抗病性研究方面,以往研究報道證實泡桐屬內不同種間及部分選育推廣優良品系,包括優選無性系和雜交種都存在著對叢枝病自然抗病與感病的差異[9,22,30-31]。其中毛泡桐‘C161’和‘毛雜16’具有對叢枝病的高度抗性,‘豫雜1號’‘陜桐4號’‘蘇桐3號’等選育品系也具有較強的抗叢枝病能力,這些相對抗病或耐病品系在重病區的普遍栽種會對病情起到一定的減緩作用[30-34]。在重病區的河南、山東、山西、陜西等地,采用當地傳統種根育苗常會導致苗期1%～5%發病率,乃至更高比率的無癥帶菌苗;而大量帶菌茶翅蝽Halyomorphahalys(St?l)的若蟲和成蟲階段持續的傳毒作用是叢枝病病情指數隨樹齡增加而逐年遞增的主要原因[10]。在河南省重病區大力推廣脫毒育苗技術杜絕了苗木的帶菌現象,且明顯降低了中幼齡泡桐的病情[35],但感病無性系‘中林3號’造林4～7年以后發病率和病情指數都快速升高,而抗病的宿縣毛泡桐定植12年內病情維持在較低水平[30,35-37]。

在環境條件方面,通過對泡桐叢枝病病情指數與氣候因子間的相關分析和回歸分析顯示,年均降水量、溫度兩大因子與病害都具有較高的相關性,但不同環境變量的作用方式和機制還需要更嚴格的試驗論證與數據支持。通過對發病泡桐的組培苗癥狀觀察發現,來自江南和西北的同種泡桐組培苗癥狀差異不明顯,而田間生長的同種泡桐癥狀差異明顯。結果進一步說明氣候因子是造成不同分布區泡桐發病程度差異的主要因素之一。在南方病害零星發生區,侵染源要遠少于北方重病區,并且相對抗病與耐病的白花泡桐分布較普遍,但是否會因南方降水量增加和溫度偏高而導致傳病介體缺乏、種群密度或傳病效率低而減少了感染幾率也是值得研究的課題。泡桐在城鎮生活區、農桐間作區、人工林區和自然保護區的種植方式和環境因素差異巨大,病害發生必然受到影響,如城鎮生活區的高大建筑物、其他植被的隔離效應等對病害傳播起到一定的抑制作用。另外有研究發現土壤因子,特別是磷、鉀等元素含量及施肥與泡桐叢枝病的發生與發展有密切的相關性[38-39]。

Thébaud等[40]根據對法國克羅平原發生的歐洲核果黃化病風險因子的調查研究,認為對人為有關的可控風險因子的有效控制是降低發病率與病情的經濟環保的防控措施。依據本研究結果,我們認為泡桐叢枝病防治應針對病害不同區劃采取有差別的防控對策。既要加強營林管理、及時修剪發病枝條以減少毒源和降低病害發生的風險,也要嚴格把控帶菌苗木的檢測和因地制宜選用適度抗病泡桐種類和品系。在城市綠化美化中推薦抗病、抗污染、空氣凈化能力強、樹型與枝葉優美、壽命長的種類。采用泡桐脫毒苗與其他非寄主樹種間種等方法物理防治叢枝病,并倡導在無病或發病很輕的地區建立脫毒苗木繁育生產基地。