佛手山藥線蟲(chóng)病害發(fā)生調(diào)查與病原鑒定

楊小林, 李夢(mèng)歡, 何中華, 胡營(yíng)營(yíng), 王高峰, 常向前,王佐乾, 肖雪瓊, 肖炎農(nóng)*, 張 舒*

(1. 湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保土肥研究所,農(nóng)作物重大病蟲(chóng)草害防控湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430064;2. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖北省植物病害監(jiān)測(cè)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430070;3. 湖北省浠水縣蔬菜水果花卉科技開(kāi)發(fā)中心, 黃岡 438200)

山藥原名“藷藇”,俗稱土薯,為藥食同源的多年生草質(zhì)藤本植物,是薯蕷科Dioscoreaceae薯蕷屬Dioscorea多個(gè)種的統(tǒng)稱[1]。山藥原產(chǎn)于亞洲和非洲,在中國(guó)南北各地區(qū)均有種植,主要分布于山西、河北、湖北、山東、河南、安徽、江蘇和江西等地[2]。

近年來(lái)山藥線蟲(chóng)病在許多國(guó)家和地區(qū)發(fā)生,嚴(yán)重影響山藥產(chǎn)量和品質(zhì)。在西非曾有緩慢盾線蟲(chóng)Scutellonemabradys、根結(jié)線蟲(chóng)Meloidogynesp.為害山藥的報(bào)道,在波多黎各、牙買(mǎi)加、英屬所羅門(mén)群島、太平洋和中美洲曾有咖啡短體線蟲(chóng)Pratylenchuscoffeae危害山藥的記載[3-4]。在烏干達(dá),蘇丹短體線蟲(chóng)已成為引起當(dāng)?shù)厣剿幘€蟲(chóng)病害的優(yōu)勢(shì)種[5]。我國(guó)于1987年首次報(bào)道薯蕷根腐線蟲(chóng)Pratylenchusdioscoreae在河南的危害;1988年-1999年間張廣民等報(bào)道在山東嘉祥發(fā)現(xiàn)穿刺根腐線蟲(chóng)Pratylenchuspenetrans危害山藥[6];2019年張海燕等在山東發(fā)現(xiàn)了根結(jié)線蟲(chóng)危害山藥[7]。賀哲等研究發(fā)現(xiàn)在江西瑞昌有山藥根腐線蟲(chóng)病的發(fā)生,并經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定該病原線蟲(chóng)為咖啡短體線蟲(chóng)Pratylenchuscoffeae[8]。莫毅君等在桂林地區(qū)淮山藥上發(fā)現(xiàn)了根腐線蟲(chóng)病發(fā)生危害,發(fā)病率為44.23%[9]。江蘇沛縣曾報(bào)道山藥根結(jié)線蟲(chóng)病的發(fā)生蔓延逐漸加重,輕病田減產(chǎn)15%～20%,重病田減產(chǎn)80%[10]。

武穴市地處湖北省東部,屬亞熱帶季風(fēng)性濕潤(rùn)氣候,適宜種植山藥[11]。該地特色農(nóng)產(chǎn)品佛手山藥因其優(yōu)良的品質(zhì)以及獨(dú)特的品種特征于2009年獲國(guó)家農(nóng)產(chǎn)品地理標(biāo)志認(rèn)證。武穴佛手山藥種植歷史悠久,據(jù)清同治壬申《廣濟(jì)縣志》記載,于唐貞觀年間開(kāi)始引入種植,至今已有1 300多年的歷史;李時(shí)珍在《本草綱目》中曾記載,佛手山藥具有健脾止瀉,補(bǔ)益氣,潤(rùn)皮毛,補(bǔ)虛羸,除寒熱邪氣,強(qiáng)筋健骨之功效[11]。目前佛手山藥栽培面積常年在66.67 hm2左右,畝產(chǎn)值達(dá)12 000元以上,其經(jīng)濟(jì)產(chǎn)值是水稻、棉花等大宗作物的3～10倍,武穴現(xiàn)已成為全國(guó)最大的“佛手山藥”生產(chǎn)基地[12-13]。近年來(lái)該地佛手山藥線蟲(chóng)病頻發(fā),但具體發(fā)生情況尚不明確,因此本研究主要對(duì)該地佛手山藥線蟲(chóng)病發(fā)生情況展開(kāi)調(diào)查,并利用形態(tài)學(xué)和分子鑒定相結(jié)合的方法,對(duì)樣品中所分離到的線蟲(chóng)進(jìn)行分類鑒定,通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析病原線蟲(chóng)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。目的在于了解武穴地區(qū)引起佛手山藥線蟲(chóng)病的線蟲(chóng)種類,為當(dāng)?shù)氐木€蟲(chóng)防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備及試劑

儀器設(shè)備:連續(xù)變倍體視顯微鏡(型號(hào)XTB-01)徠卡顯微系統(tǒng)(Leica Microsystems);生物顯微鏡(型號(hào)13395H2X)徠卡顯微系統(tǒng)(Leica Microsystems);倒置顯微鏡(型號(hào)Olympus IX71),北京普瑞賽司儀器有限公司;線蟲(chóng)分離盤(pán)(實(shí)驗(yàn)室自制);網(wǎng)篩(200目、500目);牛津杯。

1.2 山藥根際土壤樣品的采集

2021年5月在湖北省黃岡市武穴市大金鎮(zhèn)山藥專業(yè)合作社基地采集山藥及土樣。山藥基地前期生產(chǎn)依照常規(guī)用藥防控山藥線蟲(chóng)病,按自然生產(chǎn)狀態(tài)分為4類,分別為未施藥1年土(山藥苗期未施用2%阿維菌素,且上茬作物非佛手山藥)、施藥1年連作土(山藥苗期施用1次2%阿維菌素,且連續(xù)2年種植山藥)、未施藥2年連作土(山藥苗期未施用2%阿維菌素,且連續(xù)3年種植山藥)和施藥2年連作土(山藥苗期施用1次2%阿維菌素,且連續(xù)3年種植山藥)。參考洪彩鳳等[14]所描述的方法,采用五點(diǎn)取樣法分別采集上述4類山藥土樣,每類型土壤選取3塊,即重復(fù)3次取樣,用自封口塑料袋包裝,及時(shí)帶回室內(nèi)分離檢測(cè)。

1.3 線蟲(chóng)分離

量取100 mL的土壤樣品用改良淺盤(pán)法進(jìn)行線蟲(chóng)分離[15]。

1.4 樣品中線蟲(chóng)的形態(tài)學(xué)鑒定

先將待鑒定線蟲(chóng)于60℃水浴鍋3 min殺死,然后加入FAA 固定液(福爾馬林6 mL,95% 乙醇20 mL,冰醋酸1 mL,蒸餾水40 mL)固定,制成臨時(shí)玻片。在倒置顯微鏡下觀察、測(cè)量、記錄其形態(tài)學(xué)特征。線蟲(chóng)形態(tài)描述依據(jù)DeMan公式[16]。

1.5 樣品中線蟲(chóng)的分子生物學(xué)鑒定

對(duì)采集到的山藥線蟲(chóng)樣品進(jìn)行分子鑒定。單條線蟲(chóng)的DNA提取參考已報(bào)道方法[17]。線蟲(chóng)28S rRNA基因的D2/D3區(qū)采用如下引物進(jìn)行擴(kuò)增:上游引物28S-D2A:5′-ACAAGTAECGTGAGGGAAAGTTG-3′和下游引物28S-D3B:5′-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3′,反應(yīng)體系為: DNA模板1 μL, PrimeSTAR Max DNA 25 μL,上游引物和下游引物各2 μL, ddH2O補(bǔ)足至50 μL。PCR擴(kuò)增條件為:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸1 min,35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min,16℃保持。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.3%瓊脂糖凝膠檢測(cè),擴(kuò)增產(chǎn)物切膠回收,產(chǎn)物送武漢擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.6 系統(tǒng)進(jìn)化分析

系統(tǒng)進(jìn)化分析采用MEGA X 5.2軟件,根據(jù)BLAST比對(duì)結(jié)果從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載線蟲(chóng)28S rDNA 基因的D2/D3區(qū)序列作為系統(tǒng)進(jìn)化分析參考序列[18-20]。采用Clustal W方法默認(rèn)參數(shù)將本研究測(cè)序獲得的線蟲(chóng)序列與參考序列進(jìn)行比對(duì)分析。序列比對(duì)結(jié)果基于鄰接法(neighbor-joining),采用K2P 模型(kimura 2-parameter model)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),選擇自展法(bootstrap method)重復(fù)1 000次對(duì)進(jìn)化樹(shù)分支可信度進(jìn)行評(píng)估。上述序列比對(duì)結(jié)果按線蟲(chóng)種類進(jìn)行分組后,采用MEGA X 5.2軟件遺傳距離計(jì)算模塊下的相應(yīng)算法,使用算法默認(rèn)參數(shù)分析種內(nèi)及種間遺傳距離。

1.7 SCAR-PCR 特異性引物驗(yàn)證

根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)及序列比對(duì)分析結(jié)果,利用種特異性引物[21]PC1: 5′-ATGCGCACATTGCATTCAGC-3′和PC2: 5′-GAGCGAGAAACACCTCTCAC-3′對(duì)不同DNA 樣本進(jìn)行擴(kuò)增,PCR 反應(yīng)體系:DNA模板1 μL,5 μmol/L的上游引物和下游引物各2 μL,2×ExTaqMix 12.5 μL,ddH2O補(bǔ)足至25 μL。擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性4 min;94℃變性30 s,60～66℃(按引物不同)退火30 s,72℃延伸45 s,共40個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物在1.3%瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè),根據(jù)相應(yīng)引物的擴(kuò)增片段大小確定線蟲(chóng)的種類。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

用SPSS Statistics 18.0軟件的ANOVA 程序進(jìn)行方差分析,LSD 法在0.05水平分析試驗(yàn)中不同處理之間的差異。Graph軟件分析作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤樣品中線蟲(chóng)數(shù)量

對(duì)采集的山藥土樣進(jìn)行線蟲(chóng)分離,線蟲(chóng)數(shù)量如表 1所示。不同樣地類型線蟲(chóng)數(shù)量不同,不同土層深度線蟲(chóng)數(shù)量亦不相同。

從5～10 cm土層線蟲(chóng)數(shù)量看，未施用阿維菌素連作2年地>施用阿維菌素連作2年地>未施用阿維菌素1年地>施用阿維菌素連作1年地，且各地塊類型之間差異顯著。10～20 cm土層的線蟲(chóng)數(shù)量最高的為未施用阿維菌素連作2年地，顯著高于其他類型地塊，施用阿維菌素連作1年地線蟲(chóng)數(shù)量最低，顯著低于其他類型田塊，施用阿維菌素連作2年地與未施用阿維菌素1年地之間差異不顯著。20～30 cm土層的線蟲(chóng)數(shù)量分布與10～20 cm相似，未施用阿維菌素連作2年地線蟲(chóng)數(shù)量顯著高于其他類型田塊，施用阿維菌素連作1年地線蟲(chóng)數(shù)量顯著低于其他類型田塊，且施用阿維菌素連作2年地與未施用阿維菌素1年地之間差異不顯著。

施用阿維菌素1年連作地和施用阿維菌素連作2年地5～10 cm與10～20 cm土層深度線蟲(chóng)數(shù)量之間差異不顯著,但20～30 cm土層深度中的線蟲(chóng)數(shù)量顯著低于前兩個(gè)深度; 未施用阿維菌素連作2年地和未施用阿維菌素1年地地塊5～10 cm與20～30 cm土層深度之間線蟲(chóng)數(shù)量差異不顯著,但10～20 cm土層深度線蟲(chóng)數(shù)量顯著高于前兩者。

由表1可見(jiàn)未施用阿維菌素連作2年地線蟲(chóng)達(dá)381.07條/100 mL土樣,是施用阿維菌素連作2年地?cái)?shù)量的2.35倍;未施用阿維菌素1年地線蟲(chóng)達(dá)133.4條/100 mL土樣,是施用阿維菌素連作1年地?cái)?shù)量的3.34倍，且10～20 cm土層線蟲(chóng)數(shù)量最多。由此可見(jiàn):線蟲(chóng)主要集中分布于10～20 cm深度的土層中,且連作1年地較連作2年地的線蟲(chóng)數(shù)量少,施用阿維菌素的地塊較未施用的線蟲(chóng)數(shù)量少。

2.2 樣品中線蟲(chóng)種類的形態(tài)學(xué)鑒定

2.2.1形態(tài)測(cè)計(jì)值

武穴市山藥線蟲(chóng)的形態(tài)測(cè)計(jì)值見(jiàn)表2。 將該線蟲(chóng)群體的測(cè)計(jì)值與Ryss和Wang[22-23]描述的群體以及陳曉玲[24]所描述的群體相比較,其測(cè)計(jì)值基本一致。因此將該武穴群體初步鑒定為咖啡短體線蟲(chóng)Pratylenchuscoffeae。

表1 連作土壤中不同土層深度的線蟲(chóng)數(shù)量分布1)

表2 咖啡短體線蟲(chóng)武穴群體與其他群體測(cè)量值比較1)

2.2.2形態(tài)描述

雌蟲(chóng):蟲(chóng)體向腹部微彎曲呈C形,角質(zhì)層環(huán)紋明顯(圖1a),唇區(qū)縊縮(圖1b,c)。口針發(fā)達(dá),基部球呈橢圓形,具2個(gè)唇環(huán)(圖1b,c)。中食道球呈卵圓狀,食道腺狀似長(zhǎng)葉(圖1e,f)。尾端鈍圓、平截或有缺刻,尾部形態(tài)多樣且多有變異(圖1g)。

雄蟲(chóng):蟲(chóng)體相對(duì)細(xì)長(zhǎng),且形體與雌蟲(chóng)相似,交合刺頭部明顯且窄細(xì),似弓狀(圖1f),交合傘包至尾端,尾部尖細(xì)。

圖1 咖啡短體線蟲(chóng)光學(xué)顯微照片F(xiàn)ig.1 Optical photomicrograph of the Pratylenchus coffeae

2.3 樣品中線蟲(chóng)的分子生物學(xué)鑒定

在體視鏡下挑選48條線蟲(chóng)樣品,提取DNA后進(jìn)行通用引物驗(yàn)證,根據(jù)通用28S D2A/D3B引物擴(kuò)增的片段大小初步鑒定線蟲(chóng)的種類,共擴(kuò)增出48條785 bp條帶。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送測(cè)后進(jìn)行BLAST分析比對(duì),初步結(jié)果顯示,線蟲(chóng)樣本中有46條為咖啡短體線蟲(chóng)Pratylenchuscoffeae,2條為擬麗突線蟲(chóng)Acrobeloidesnanus,咖啡短體線蟲(chóng)占線蟲(chóng)總數(shù)的95.83%,從上述結(jié)果可知:該地區(qū)短體線蟲(chóng)優(yōu)勢(shì)種類為咖啡短體線蟲(chóng)。

圖2 短體線蟲(chóng)種群 rDNA 28S D2A/D3B基因擴(kuò)增片段Fig.2 Fragments of rDNA 28S D2A/D3B genes amplified from Pratylenchus nematodes

2.4 短體線蟲(chóng)種群的系統(tǒng)進(jìn)化分析

從NCBI分別下載來(lái)自中國(guó)、法國(guó)、泰國(guó)等國(guó)家的短體線蟲(chóng)不同種群rDNA 28S D2/D3序列,與本研究獲得的序列一起構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖3),以四翼無(wú)刺線蟲(chóng)Aspiculuristetraptera(KF444351.1)和食細(xì)菌線蟲(chóng)-擬麗突線蟲(chóng)(WX48)作為rDNA 28S樹(shù)的外群。基于rDNA 28S D2/D3序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖 3)顯示武穴山藥短體線蟲(chóng)WX45與泰國(guó)群體(MK346210.1)聚類在一個(gè)分支上,置信度達(dá)98%,與香港群體(HQ688677.1)聚集在同一分支上,置信度高達(dá)99%。

圖3 基于rDNA 28S D2A/D3B序列構(gòu)建的部分武穴市短體線蟲(chóng)種群鄰接法系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of partial Pratylenchus species on wheat in Wuxue region of China based on rDNA 28S D2A/D3B sequences using neighbor-joining method

2.5 短體線蟲(chóng)種群的SCAR 引物檢測(cè)

利用SCAR引物對(duì)48條線蟲(chóng)DNA樣本進(jìn)行擴(kuò)增,結(jié)果顯示,咖啡短體線蟲(chóng)SCAR引物對(duì)PC1/PC2共擴(kuò)增出46條約630 bp的條帶(圖4),表明這些樣本均為咖啡短體線蟲(chóng)。SCAR檢測(cè)結(jié)果表明,48條山藥線蟲(chóng)樣品單條DNA 樣本中,46條為咖啡短體線蟲(chóng),與上述基于rDNA序列分析得出的結(jié)果一致。

圖4 短體線蟲(chóng)種群的特異性引物檢測(cè)Fig.4 Identification of Pratylenchus species using the species-specific primers

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)對(duì)從武穴市佛手山藥種植區(qū)自然發(fā)病土壤中分離得到的線蟲(chóng),通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察,發(fā)現(xiàn)與王碩等[25]、趙來(lái)順等[26]學(xué)者報(bào)道的咖啡短體線蟲(chóng)相接近。進(jìn)一步通過(guò)分子生物學(xué)鑒定,將山藥病原線蟲(chóng)的PCR擴(kuò)增序列與其進(jìn)行比對(duì),得出山藥病原線蟲(chóng)為咖啡短體線蟲(chóng)Pratylenchuscoffeae,與劉海璐等[21]的研究報(bào)道相一致。

土壤線蟲(chóng)數(shù)量與土壤含水量顯著相關(guān),食細(xì)菌線蟲(chóng)、食真菌線蟲(chóng)以及植物線蟲(chóng)在不同土壤深度其數(shù)量存在著顯著變化,土壤水分被證明是影響線蟲(chóng)密度和營(yíng)養(yǎng)的最重要變量之一[27-28]。劉方明等[29]的研究表明,玉米地10～20 cm土層土壤線蟲(chóng)的數(shù)量顯著高于20～30 cm土層。

本研究對(duì)采集連作地的土樣進(jìn)行調(diào)查,結(jié)果表明,在同樣施用阿維菌素的情況下,連作1年土中的線蟲(chóng)數(shù)量明顯少于連作2年土中的線蟲(chóng)數(shù)量。山藥忌連作重茬重溝栽植[30]，否則易引發(fā)山藥病害,造成山藥減產(chǎn)甚至絕收。表明藥劑防治對(duì)于重茬連作山藥病害有一定的防治效果。阿維菌素是防治新茬山藥病害的常用藥劑,對(duì)于重茬連作山藥病害,許念芳等[31]報(bào)道2%阿維菌素微囊劑30倍液、30%辛硫磷30倍液和30%噻唑膦60倍液混合后噴施到山藥種植溝中,對(duì)重茬地山藥線蟲(chóng)病防治效果較好。

本次研究明確了造成武穴市佛手山藥根腐病的病原線蟲(chóng)種類,初步探索了線蟲(chóng)在土中的分布情況,明確提出輪作和施用藥劑對(duì)于保障山藥健康生長(zhǎng)有必要。前期所分離到的擬麗突線蟲(chóng)并非植物病原線蟲(chóng)而是土壤中常見(jiàn)的食細(xì)菌線蟲(chóng),因此,對(duì)于引起佛手山藥根腐病的病原除了咖啡短體線蟲(chóng)外是否還有其他病原還需進(jìn)一步的研究論證。篩選新的藥劑進(jìn)行山藥多病害的高效防治亦是未來(lái)研究的主題。